家蠶核型多角體病毒Bm41和Bm51基因分析.pdf

1、到目前為止，有48種昆蟲桿狀病毒的基因組被完全測序，而家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucloepolyhedrivirus，BmNPV)作為桿狀病毒的模式病毒之一，得到了越來越廣泛的研究和應用.目前，有許多基因的功能已了解清楚，例如Bm67、Bm56、Bm9等，但仍有許多基因的功能尚是未知。本研究中，選取了orf41和orf51兩個功能未知基因為研究對象，從基因的轉(zhuǎn)錄、表達、亞細胞定位、病毒結(jié)構(gòu)定位、基因缺失等方面研究基因的

2、基本特性及其初步功能，從而豐富桿狀病毒分子生物學理論，并為下一步深入分析基因功能和相關病毒基因工程研究提供基礎。 本研究的主要結(jié)論如下： 1.BmNPVorf41(Bm41)基因分析Bm41位于BmNPV(T3株)基因組39204-39788nt，讀碼框全長585bp，編碼194個氨基酸，預測分子量約為23.3kDa.在Bm41起始密碼子ATG上游146nt處有一桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序CAGT。用BLASTP工具搜索Gen

3、Bank和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在25種目前已經(jīng)測序的鱗翅目基因組中存在Bm41的同源序列，包括GroupINPV和GroupIINPV，但在于鱗翅目GVs和其它桿狀病毒并未發(fā)現(xiàn)。因而推測，Bm41及它的同源基因是鱗翅目昆蟲核型多角體病毒特有基因，在其它桿狀病毒寄主系統(tǒng)中，這個基因可能是非必需的或細胞內(nèi)因子可以補償這種缺陷。 為了進一步研究Bm41在病毒侵染循環(huán)中的作用，利用ET重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了Bm41的突變病毒，進

4、而利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建了一個在多角體位點重新補回Bm41的補回病毒，電鏡分析表明，敲除Bm41影響了病毒核衣殼的形成以至進一步影響了成熟的ODV形成多角體。Westernblot分析表明，Bm41既不是ODV也不是BV的結(jié)構(gòu)蛋白的組成部分。細胞內(nèi)定位表明，Bm41可能在細胞核和細胞質(zhì)均有功能。轉(zhuǎn)錄和表達時相表明Bm41是一個早期轉(zhuǎn)錄的基因。用突變的病毒感染細胞樣品進行westernblot分析表明，一些晚期基因的表達受到了影

5、響，ODV-EC27的表達受到了明顯的下調(diào)，多角體基因的表達則受到了抑制，不再表達。 生物測定分析表明，與突變前野生病毒相比，突變的Bm41病毒延長了宿主昆蟲的LT50，也提高了宿主昆蟲的LD50。BV滴度分析表明，Bm41的突變大大降低了BV在細胞內(nèi)的產(chǎn)量。 綜上所述，BmNPVorf41是一個早期基因，編碼的蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白無關。Bm41的突變影響了病毒DNA復制并在細胞和蟲體內(nèi)產(chǎn)生了很低產(chǎn)量的BV。而且，Bm41缺少

6、的病毒對宿主昆蟲的感染力降低并延長了對宿主昆蟲的致死時間。電鏡分析表明，Bm41的突變影響了核衣殼的形成。因此推測，Bm41盡管不是病毒復制的必需基因，但是在BV和ODV形成方面均起著重要作用，且是影響病毒在體內(nèi)和體外感染力的重要基因。 2.BnNPVorf51(Bm51)基因分析Bm51位于BmNPV(T3株)基因組45935-46402nt，讀碼框全長468bp，編碼一個長155個氨基酸殘基的蛋白，預測分子量為18.5kDa

7、。在Bm51起始密碼子ATG上游26nt處有1個桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序CAGT。RT-PCR分析表明，Bm51在4.5hp.i.開始轉(zhuǎn)錄。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了GST-Bm51融合蛋白并利用該蛋白制備了多克隆抗血清。利用此抗血清進行Bm51的表達時相分析發(fā)現(xiàn)，Bm51的表達產(chǎn)物在6hp.i.被檢測出來。以上試驗結(jié)果表明，Bm51是一個桿狀病毒早期表達基因。 利用抗Bm51的特異性抗體，對提取純化的BV和ODV進行了wester

8、nblot分析，在提純的BV泳道中出現(xiàn)了的23kDa陽性條帶。在ODV中沒有檢測出陽性條帶。因此Bm51蛋白是BV特異性的結(jié)構(gòu)蛋白。為了精確確定Bm51在BV中的定位。進一步將BV分離為BV核衣殼蛋白(BV-NC)和BV囊膜蛋白(BV-E)。利用Bm51抗體去雜交BV-NC和BV-E，發(fā)現(xiàn)只能在BV囊膜蛋白(BV-E)上雜交到陽性條帶，而在BV-NC并沒有任何條帶。說明Bm51基因編碼了與BV核衣殼相關的結(jié)構(gòu)蛋白。 為了對Bm5