煙草Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的分離及功能鑒定.pdf

1、植物病害是世界范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量的最嚴(yán)重的生物脅迫之一，嚴(yán)重影響了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。而80％的作物病害是由病原真菌引起的。立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)是半知菌亞門絲核菌屬的一個(gè)種，為死體營養(yǎng)菌，分布廣、寄主范圍大，常以菌核形態(tài)習(xí)居土壤，是小麥、玉米、水稻等禾本科作物紋枯病，草坪草褐斑病，馬鈴薯、棉花、大豆、煙草立枯病的致病菌。雖然該病研究多年，但研究進(jìn)展較少，主要進(jìn)展也僅僅集中在生物防治領(lǐng)域。在植物抗病基因工程中，通

2、過將抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入植物來提高農(nóng)作物對真菌病害的抗性已成為一種直接有效的方法，并且在一些重要作物改良中取得了一定進(jìn)展。 本研究通過構(gòu)建真菌誘導(dǎo)煙草幼苗cDNA文庫，并用反向Northern差異篩選法獲得一個(gè)與生物脅迫相關(guān)的Kunitz型蛋白酶抑制劑基因NtKTI1。本研究對NtKTI1基因序列、表達(dá)及生物學(xué)功能進(jìn)行了重點(diǎn)分析，主要研究結(jié)果如下： 1、利用Clontech SmartTM cDNA Library Con

3、struction Kit構(gòu)建真菌誘導(dǎo)煙草cDNA文庫，通過反向Northern差異篩選法分離獲得一個(gè)長563bp的cDNA片斷。應(yīng)用RACE技術(shù)得到這個(gè)基因的全長，命名為NtKTI1。該基因全長840bp，編碼區(qū)長627bp。估計(jì)分子量為23.1kDa，等電點(diǎn)為9.36。該基因在GenBank中的注冊號為FJ494920。 2、同源比對分析表明NtKTI1與非洲奇果蛋白、植物Kunitz型蛋白酶抑制劑等蛋白具有很高的同源性，分

4、子內(nèi)有兩對二硫鍵和一個(gè)活性中心。使用JPred，SWISSMODEL，CPHmodels和ESyPred3D等蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫在線分析表明NtKTI1與KTI3具有類似的三維結(jié)構(gòu)。隨后使用Swiss-Model和RasMol構(gòu)建了NtKTI1的三維模型。 3、采用生物信息學(xué)的手段在擬南芥和水稻基因組數(shù)據(jù)庫中搜尋NtKTI1的同源基因，從擬南芥中找到7個(gè)，水稻中僅找到1個(gè)。聚類分析表明NtKTI1與AtIg17860，A

5、tIg73260，Os04g0526600聚到一個(gè)進(jìn)化枝上。 4、RT-PCR及Northern表達(dá)分析表明NtKTI1在根和莖中表達(dá)量最高，其次是花和葉中，在種子中的表達(dá)量很低。在尼R.solani，SA和傷處理時(shí)，NtKTI1在一定的時(shí)間范圍內(nèi)其表達(dá)水平隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長而降低，但不受MeJA，ABA和NaCl處理的影響。由PRIc的表達(dá)模式推測煙草在立枯絲核菌侵染時(shí)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式類似于傷信號是依賴SA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 5

6、、使用hiTAIL-PCR的方法擴(kuò)增得到NtKTI1長為1471bp的調(diào)控序列，PlantCare預(yù)測出多個(gè)逆境脅迫響應(yīng)元件。 6、構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)純化得到缺失信號肽序列而帶有組氨酸標(biāo)簽的NtKTI1融合蛋白。酶活測定結(jié)果表明該融合蛋白具有胰蛋白酶抑制劑活性。抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果表明該融合蛋白對立枯絲核菌具有很強(qiáng)的抑菌活性，對桃根霉、煙草疫霉的抑菌活性較弱，但對細(xì)菌如E.Coli沒有作用。 7、構(gòu)建NtKTI1的植物正義反