石斑魚虹彩病毒(SGIV)兩個立即早期基因的分子克隆與特征分析.pdf

1、虹彩病毒的基因根據(jù)轉(zhuǎn)錄的先后順序可以將其分為三個時(shí)期：立即早期(immediate-early，IE)、早期(early，E)和晚期(late，L)。IE基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒DNA復(fù)制之前，作為病毒感染宿主后在細(xì)胞中最早表達(dá)的一類基因，IE基因可以對病毒基因和宿主細(xì)胞基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并能夠影響宿主細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞免疫反應(yīng)。IE基因在病毒感染復(fù)制、宿主細(xì)胞生長調(diào)控和免疫逃避等方面具有重要功能。石斑魚虹彩病毒(Singapore

2、 grouperiridovirus，SGIV)是近年從養(yǎng)殖石斑魚中分離到的一種高致病性病原，可導(dǎo)致石斑魚死亡率達(dá)90％以上，引起了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)已發(fā)表的虹彩病毒科成員的全基因組序列，通過GenBank同源搜索和氨基酸比對分析，在SGIV中發(fā)現(xiàn)兩個非常有意義的預(yù)測為IE基因的ORFs: ORF086R和ORF162L，它們分別編碼ICP18(infected cell protein18)和ICP46( infected cell

3、 protein46)的同源類似物。本論文即在分子水平對SGIV ICP18(ORF086R)和SGIV ICP46(ORF162L)這兩個立即早期基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、特征分析和功能探索。
　　 序列分析表明，ICP18是蛙病毒屬特有的核心基因，而ICP46為整個虹彩病毒科的核心基因之一。通過生物信息學(xué)分析，未在ICP18和ICP46家族中找到已知有意義的功能結(jié)構(gòu)域，目前它們的功能都是未知的。我們構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-I

4、CP18和pET-ICP46，成功地在原核細(xì)胞E.coli BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了ICP18和ICP46的重組融合蛋白，并摸索出了可溶性重組蛋白的高效表達(dá)條件及純化方法。用純化的重組蛋白作為抗原免疫小鼠，制備了高效特異的SGIV ICP18抗血清和SGIV ICP46抗血清。
　　 用放線菌酮(cycloheximide，CHX)和阿糖胞苷(cytosine arabinoside，AraC)進(jìn)行藥物抑制實(shí)驗(yàn)，

5、證實(shí)SGIV ICP18和SGIV ICP46基因都是立即早期基因。通過RT-PCR和western blot分析表明，SGIV ICP18基因在感染后2h即開始轉(zhuǎn)錄，在感染后6h開始合成蛋白，并在此后的感染周期中其轉(zhuǎn)錄表達(dá)持續(xù)進(jìn)行；SGIV ICP46基因在感染后2h開始轉(zhuǎn)錄，在感染后4h開始合成蛋白，并且在感染后4h至48h持續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及蛋白合成。Western blot檢測證實(shí)SGIV ICP18是一個病毒核衣殼蛋白，而SGIV

6、ICP46被發(fā)現(xiàn)是一個新的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并且包裝于病毒的核衣殼部分。Western blot檢測還發(fā)現(xiàn)，ICP18雜交條帶的分子量比其推定的分子量稍大，而ICP46有44 KDa和46KDa兩條特異性雜交條帶，暗示ICP18和ICP46蛋白在病毒感染細(xì)胞的過程中可能發(fā)生了一定的修飾。通過真核轉(zhuǎn)染和熒光顯微鏡觀察，表明SGIV ICP18在石斑魚胚胎細(xì)胞(Grouper embryocells，GP)和胖頭鯉細(xì)胞(Fathead minn

7、ow cells，F(xiàn)HM)兩種細(xì)胞內(nèi)均呈點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)中，且在感染晚期，ICP18主要以點(diǎn)狀聚集圍繞于病毒加工廠(viralfactories)的周圍，表明SGIV ICP18可能參與病毒加工廠的形成和病毒的裝配；而SGIV ICP46在GP和FHM兩種細(xì)胞內(nèi)主要均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，在感染晚期也少量分布于細(xì)胞核和病毒加工廠區(qū)域。
　　 采用過量表達(dá)、RNA干擾和His pull-down對SGIV ICP18和SGIV ICP

8、46的功能進(jìn)行了初步研究。由真核轉(zhuǎn)染和G418篩選得到過量表達(dá)SGIV ICP18或SGIV ICP46的GP細(xì)胞和FHM細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長曲線進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)SGIV ICP18可以明顯促進(jìn)GP和FHM細(xì)胞的生長速度，而SGIV ICP46對GP和FHM細(xì)胞的生長也有一定促進(jìn)作用，表明ICP18和ICP46可能參與細(xì)胞的生長調(diào)控。通過對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中病毒生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)SGIV IC

9、P18和SGIV ICP46都可以顯著提高SGIV的滴度，表明ICP18和ICP46可能對病毒復(fù)制有重要作用。RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)合成的siRNA-ICP18和s1RNA-ICP46能在轉(zhuǎn)染后24-48h有效抑制細(xì)胞中外源導(dǎo)入ICP18和ICP46基因的表達(dá)，但對SGIV體外感染過程中內(nèi)源ICP18和ICP46基因的轉(zhuǎn)錄抑制效果不明顯。His pull-down找到5條可能與ICP18和ICP46有相互作用的病毒蛋白條帶，但質(zhì)譜分析