地衣芽孢桿菌W10β-甘露聚糖酶基因的克隆、表達(dá)及功能.pdf

1、β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含β-1，4-D-甘露糖苷鍵的甘露多糖的半纖維素酶，它的水解產(chǎn)物，即2-10個(gè)單糖分子構(gòu)成的低聚糖，能激活植物的防御系統(tǒng)誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗病性。本研究通過酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)W10是一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶較高的生防細(xì)菌。 通過PCR技術(shù)從W10菌株基因組中擴(kuò)增出β-甘露聚糖酶基因保守區(qū)序列約750bp，該片段與已報(bào)道枯草芽孢桿菌(B.subtilis)A

2、33的β-甘露聚糖酶相似性達(dá)99％。根據(jù)A33開放閱讀框再設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得β-甘露聚糖酶全長(zhǎng)基因1017bp片段。該基因編碼的β-甘露聚糖酶有338個(gè)氨基酸，分子量預(yù)測(cè)為39.5kD，屬糖苷水解酶家族26。 以pET-22b(+)為載體、peIB為信號(hào)肽、IPTG為誘導(dǎo)物，將β-甘露聚糖酶基因轉(zhuǎn)入Escherichia coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，并優(yōu)化酶外泌條件。研究表明，在SOC培養(yǎng)基中，菌體37℃培養(yǎng)至濃度

3、OD600達(dá)0.75時(shí)，加入終濃度為0.25mM IPTG，并置28℃8h后，測(cè)得培養(yǎng)基上清中酶活力可達(dá)19.73 U/ml。 將原核表達(dá)的粗酶液經(jīng)金屬鎳柱層析得到電泳純?chǔ)?甘露聚糖酶。純酶性質(zhì)研究表明，以角豆膠為底物時(shí)，該酶在40-60℃、pH6.0-7.5時(shí)活力穩(wěn)定，而在55℃、pH7.0時(shí)活力最高。供試的大部分金屬離子對(duì)酶活力影響較小，但Ag+、Mn7+對(duì)酶活有一定的抑制作用；EDTA和SDS強(qiáng)烈抑制酶的活力，但DTT對(duì)酶