水稻白葉枯病菌新小種致病力變異的分子機(jī)理.pdf

1、水稻是我國最重要的糧食作物。由黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白葉枯病是我國水稻生產(chǎn)中的主要病害之一。由于病原菌致病性的變異,常常導(dǎo)致水稻抗病品種感病,造成水稻的減產(chǎn)和重大經(jīng)濟(jì)損失。白葉枯病菌新小種HUB05-8和HAN08-1的致病力發(fā)生變化后,能使含廣譜抗性基因Xa21水稻品種感病,論文研究了它們致病力變異的分子機(jī)理。試驗(yàn)首先利用PCR和測序技術(shù),獲得HuB05-8和HAN08-1

2、致病性相關(guān)基因的DNA序列,然后通過生物信息學(xué)的手段,與對照菌株P(guān)XO99A基因組序列進(jìn)行比對,了解致病相關(guān)基因的差異,再通過構(gòu)建載體和遺傳轉(zhuǎn)化,將具有致病功能的基因片段轉(zhuǎn)入供試菌株,觀察其致病性的變化。并利用RT-PCR的方法驗(yàn)證這些致病性相關(guān)基因的表達(dá),分析其調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明:
　　 (1)根據(jù)NCBI已發(fā)布的,與Xoo毒性因子硫化蛋白Ax21分泌相關(guān)的致病性基因序列,設(shè)計(jì)引物,通過擴(kuò)增和測序,獲得了HuB05-8和H

3、AN08-1菌株致病性相關(guān)的9個(gè)基因序列。
　　 (2)經(jīng)生物信息學(xué)分析,HuB05-8和HAN08-1菌株均在Ax21上發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基(A-G)發(fā)生變異,所編碼的氨基酸則由帶正電荷的賴氨酸突變?yōu)閹ж?fù)電荷的谷氨酸。此外,raxA和raxB基因也有少許堿基發(fā)生了變化,包括一些同義突變,但其它基因在序列上無差異。
　　 (3)將PXO99A中raxA、raxB和Ax21基因與中間載體pEASY連接,再克隆到表達(dá)載體PHM1上,

4、最后轉(zhuǎn)入HuB05-8和HAN08-1菌株中表達(dá)。結(jié)果表明,raxA和raxB基因的變化對其致病性發(fā)生變異的影響甚小,而Ax21基因中一個(gè)堿基發(fā)生變化,顯著改變了整個(gè)白葉枯病菌的致病能力。推測raxA和raxB基因可能只是編碼Ax21蛋白分泌的通道,少數(shù)堿基的變異可能不改變其分泌能力。但是,Ax21基因中的一個(gè)堿基發(fā)生變異可能會影響基因表達(dá),也可能影響了其編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致變異PAMP(Pathogen-associated m

5、olecular pattern,PAMP)分子無法被PRR-XA21(Pattern recognition receptor,PRR)識別,激發(fā)水稻的抗病反應(yīng)。
　　 (4)在對Ax21活性具有重要作用的八個(gè)基因中,raxA,raxB和raxC是Ⅰ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)基因,為組成型表達(dá);raxP、raxQ和raxST是硫化相關(guān)的基因,不受菌群效應(yīng)的影響,屬于穩(wěn)定性的表達(dá)基因;raaH和raxR屬于雙組份調(diào)控系統(tǒng),在菌群密度極低或

6、極高的情況下,表達(dá)量升高,可能介導(dǎo)QS(Quorum seining)分子Ax21的信號傳遞。
　　 (5)當(dāng)PXO99A、HAN08-1和HuB05-8的菌群密度一致(OD600值均為1.0)時(shí),致病力變異的新小種HAN08-1和HuB05-8的Ax21,raxHR、raxSTAB的表達(dá)量明顯低于PXO99A,而raxPQ、raxC的表達(dá)量無差異,表明HAN08-1和HuB05-8的致病力的變異可能和Ax21,raxHR、ra