番茄轉(zhuǎn)錄輔激活子LeMBF1在轉(zhuǎn)基因材料中的功能分析.pdf

1、轉(zhuǎn)錄輔激活因子在真核基因表達(dá)中通過橋連轉(zhuǎn)錄因子/其他調(diào)控元件和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置起著十分重要的作用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄輔激活因子的作用可將其分為兩類：一類是促進(jìn)或保持修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶的活性；一類是通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合促進(jìn)一般轉(zhuǎn)錄裝置與啟動子的結(jié)合，多蛋白橋梁因子(multiprotein bridging factor1，MBF1)就屬于這一類。MBF1是一個高度保守的關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞分化、激素調(diào)節(jié)、脂類代謝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和組氨酸新陳代謝等不同過程的轉(zhuǎn)

2、錄輔激活蛋白，不同有機(jī)體的MBF1蛋白通過與C-Jun、GCN4、ATF1或其他核受體的相互作用連接TATA盒蛋白激活基因轉(zhuǎn)錄。植物MBFls參與植物的生長發(fā)育和多種脅迫反應(yīng)，超表達(dá)MBF1可以調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和激活多種防御因子的表達(dá)，提高植物對多種脅迫的抵抗力，如高溫，干旱，病原菌侵染等，為培育高抗性的轉(zhuǎn)基因作物提供了新的路徑。目前在番茄中關(guān)于此基因還沒有相關(guān)的報道，本論文擬通過在番茄中超表達(dá)MBF1基因研究其對逆境脅迫的抗性能力

3、，從而明確MBF1基因的分子作用機(jī)制，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1、再生番茄植株的獲得
　　 將LeMBF1基因與經(jīng)PstI酶切的pDH51載體連接形成中間載體，再經(jīng)EcoR I酶切獲得了包含35S啟動子、MBF1基因、35S終止子的片段，此片段與經(jīng)EcoR I酶切的pBIN19載體連接，構(gòu)成雙元表達(dá)載體質(zhì)粒pBIN19-MBF1。以AC++番茄子葉為外植體，通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，將CaMV35S啟動子調(diào)控

4、下的MBF1基因轉(zhuǎn)入番茄，經(jīng)過50 mg/L Kan及500 mg/L的Sm篩選，獲得一部分生根的再生植株。
　　 2、Southern分析
　　 選擇11個轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行Southern分析，結(jié)果表明在這些轉(zhuǎn)化株系中有8個是多拷貝，有3個是單拷貝。
　　 3、Northern分析
　　 選擇04、05、08和09進(jìn)行Northern分析，檢測結(jié)果顯示這4個株系中LeMBF1均獲得表達(dá)。
　　 4、

5、下游基因檢驗
　　 克隆番茄Actin、PR1、PR2、PR4、PR6、Pti4、HSP90、Apx2、CHS和Zat基因的片段，以Actin為內(nèi)參，在AC++植株和轉(zhuǎn)基因植株中進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果顯示：1)HSP90、Apx2、Zat、PR1、PR4和PR6基因的表達(dá)水平在LeMBF1超表達(dá)植株中均明顯增強(qiáng)，LeMBF1正調(diào)控這些基因；2)CHS，PR2和Pti4基因的表達(dá)水平在AC++植株和轉(zhuǎn)基因植株中沒有明顯變

6、化，表達(dá)量基本一致。
　　 5、生物脅迫實驗
　　 用芽孢桿菌侵染AC++和轉(zhuǎn)基因植株的葉片，利用平板菌落計數(shù)法檢測葉片上的菌落總數(shù)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因植株對細(xì)菌的抵抗力顯然比AC++植株強(qiáng)。用赤霉菌侵染AC++和轉(zhuǎn)基因植株的葉片，以Actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量RT-PCR分析下游防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示：1)在AC++植株中，LeMBF1、PR1、PR2、PR4、PR6和Pti4基因的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。2)在轉(zhuǎn)基因植株

7、中，LeMBF1、PR2、PR4、PR6和Pti4基因的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，但PR1基因的表達(dá)水平輕微減弱。3)與AC++植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中LeMBF1、PR2、PR4和Pti4基因的表達(dá)水平明顯較高，而是PR1和PR6基因的表達(dá)水平反而低。LeMBF1可能通過激活部分PRs和Pti4基因的表達(dá)提高植物的抗病性。
　　 6、高溫實驗
　　 將AC++植株和轉(zhuǎn)基因植株放置于39℃高溫，統(tǒng)計植株在高溫下的存活率。結(jié)果顯示：

8、轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性比AC++植株強(qiáng)。利用半定量RT-PCR分析高溫條件下防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因在AC++和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。結(jié)果顯示：1)在AC++和轉(zhuǎn)基因植株中，LeMBF1、PR1、HSP90、Apx2、CHS和Zat基因的表達(dá)水平均明顯升高。2)與AC++植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中LeMBF1、PR1、HSP90、Apx2和Zat基因的表達(dá)水平明顯較強(qiáng)，而CHS基因的表達(dá)水平在30 min內(nèi)較強(qiáng)，隨后反而稍弱。LeMBF1可能通過激活PR