家蠶絲腺特異高量表達絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究.pdf

1、家蠶絲腺是合成絲蛋白的重要器官，家蠶絲腺中的絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類重要的蛋白酶抑制劑，有研究報道其可能和家蠶絲蛋白的合成和保護有關。要闡明家蠶絲蛋白高效特異合成的機理，家蠶絲腺中絲氨酸蛋白酶抑制劑的調控作用是關鍵問題之一，但目前其相關研究報道還較少。2003年本實驗室成功繪制了家蠶基因組框架圖，2006年完成了家蠶全基因組的寡核苷酸芯片的研制以及從基因水平、表達水平和蛋白質水平建立了功能基因組研究平臺，為我們系統(tǒng)分析家蠶絲腺絲氨酸蛋白

2、酶抑制劑的種類、結構特征和進化關系提供了研究基礎和技術保障。本研究首先利用蛋白質研究方法對家蠶絲腺中的胰蛋白酶抑制劑多態(tài)性進行了調查，然后利用分子生物學和生物信息學方法對家蠶絲腺中的絲氨酸蛋白酶抑制劑進行了全基因組數(shù)據(jù)鑒定，對其中重要的抑制劑基因進行了克隆和原核表達。主要結果如下： 1．家蠶絲腺中絲氨酸蛋白酶抑制劑的多態(tài)性調查利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native—PAGE)和胰蛋白酶抑制劑(TI)活性染色方法對25個家蠶品

3、系絲腺的胰蛋白酶抑制劑的多態(tài)性分布進行了調查，電泳圖譜分析表明在家蠶絲腺中共檢測到6種TIs，按遷移度分別命名為：TI—Ⅰ、TI—Ⅱ、TI—Ⅲ、TI—Ⅳ、TI—Ⅴ和TT—Ⅵ，不同品系中所含的TI種類不同。以家蠶大造為例，我們對同一品系不同組織器官中的TI類型進行調查發(fā)現(xiàn)，TI在組織間存在多態(tài)性，絲腺中的TI種類與其它組織含有的TI種類不同，具有特異性。以家蠶品系大造和21-872為例，對不同品系5齡不同發(fā)育時期絲腺的TI種類進行調查發(fā)現(xiàn)

4、，品系不同，TI種類不同；而不同的TI種類其活性檢測到的發(fā)育時期不同，但所有TI種類的活性都隨著發(fā)育時期的進行而逐漸增強，吐絲第2天達到最大，后慢慢降低，蛹第1天時幾乎檢測不到活性。 2．家蠶繭殼中絲氨酸蛋白酶抑制劑的理化性質初探利用Native—PAGE和TI活性染色方法，我們對家蠶陳舊繭殼中的TI活性進行了調查，發(fā)現(xiàn)家蠶陳舊繭殼中的TI活性較新鮮繭殼相對降低，個別TI種類活性甚至消失。利用不同pH和溫度處理家蠶繭殼發(fā)現(xiàn)，TI

5、種類不同，其對酸堿和溫度的穩(wěn)定性不同，其中TI—Ⅵ對pH和溫度最穩(wěn)定。 3．家蠶絲腺絲氨酸蛋白酶抑制劑的種類、結構特征和進化關系利用家蠶全基因組數(shù)據(jù)、基因芯片和EST數(shù)據(jù)，對家蠶絲腺中的絲氨酸蛋白酶抑制劑進行了全基因組數(shù)據(jù)鑒定，在家蠶絲腺中共鑒定了14種絲氨酸蛋白酶抑制劑特異高量表達，分別命名為：BmSPIs1～BmSPIs14，都有EST證據(jù)。利用NCBI中的BIAST工具和結構預測工具SMART對這14種絲氨酸蛋白酶抑制劑的

6、結構進行了預測，結果顯示BmSPIs3、BmSPIs4、BmSPIs5、BmSPIs6、BmSPIs7和BmSPIs8具有Serpin型結構域；BmSPIs1、BmSPIs2和BmSPIs9具有TIL結構域；BmSPIs12、BmSPIs13和BmSPIs14屬于Kunitz型結構域；BmSPIs11屬于Kaza1型結構域；而BmSPIs10既有Serpin又有TIL結構域。采用ClustalW程序和MEGA程序中的鄰接法對這14種絲氨

7、酸蛋白酶抑制劑與其它物種中的絲氨酸蛋白酶抑制劑構建進化樹發(fā)現(xiàn)，相同結構域的抑制劑首先聚在一起，說明家蠶絲腺特異高量表達的這四種結構域的絲氨酸蛋白酶抑制劑在物種間是比較保守的。 4．家蠶絲腺絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆和原核表達利用RT—PCR技術，我們對家蠶絲腺特異高量表達的BmSPIs5、BmSPIs6、BmSPIs8、BmSPIs13和BmSPIs14五種抑制劑進行了組織表達譜驗證，進一步對這5個基因進行了TA克隆，獲得了完整的