金龜子綠僵菌MaECM33基因的克隆及分析.pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一類應用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲防治中起著重要作用。近十多年來，在綠僵菌的致病機制、高毒力菌株選育和應用技術等方面都取得了長足進展，并實現(xiàn)了商品化。綠僵菌已成功的用于防治沙漠飛蝗、東亞飛蝗等多種蝗蟲，已成為防治蝗蟲的主要微生物農(nóng)藥，殺蝗綠僵菌1989年被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦為環(huán)保產(chǎn)品推廣應用。作為一種觸殺性微生物殺蟲劑，金龜子綠僵菌以孢子為殺蟲單元侵染昆蟲，但是由于

2、高溫、紫外線輻射、干燥等逆境對孢子的不利作用，殺蟲真菌制劑在田間應用中的防效受到明顯影響。而且在傳統(tǒng)的真菌殺蟲劑研制中，菌株的選育注重于高毒力菌株的選育，忽略了產(chǎn)孢過程對商品制劑生產(chǎn)的影響和孢子特性對菌株毒力以及制劑貨架時間、田間時效性的影響。所以除了常規(guī)育種來選育高毒力菌株和分子生物學方法鑒定分離毒力相關基因之外，也應該重視孢子特性和產(chǎn)孢相關基因的克隆和鑒定，從而闡明產(chǎn)孢及孢子特性等重要相關性狀形成的分子機制。這直接關系到縮短產(chǎn)孢時間

3、，提高產(chǎn)孢率，增強孢子耐儲藏性、抗逆境性等重要的劑型研制目標，為選育產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢率高、孢子特性優(yōu)良的工程菌株提供相應的理論依據(jù)和目的基因，從而更好地實現(xiàn)綠僵菌作為生物殺蟲劑的規(guī)?；瘧?。
　　 目前，對于金龜子綠僵菌產(chǎn)孢的研究，主要是從環(huán)境因素和理化因子的角度來探索，而對于其孢子形成的分子機制的系統(tǒng)研究還少見報道。為了填補這個領域的空缺，本實驗室已經(jīng)利用消減雜交技術分別得到大量綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢和正常產(chǎn)孢時產(chǎn)孢細胞形成過程中差異表

4、達的基因。
　　 本文選取其中一個上調(diào)表達的基因，在PCR擴增金龜子綠僵菌產(chǎn)孢時期均一化cDNA全長文庫和篩選金龜子綠僵菌基因組文庫的基礎上，獲得了該基因的cDNA全長序列和DNA序列，并命名為MaECM33。同時，構建MaECM33基因的RNA干擾載體并轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌，以期利用RNA干擾的方法來研究該基因的功能。根據(jù)試驗結(jié)果主要得出以下結(jié)論：
　　 1.克隆了金龜子綠僵菌ECM33基因的cDNA，序列全長1396bp

5、含有一個1167bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼388個氨基酸的蛋白質(zhì)。提交GenBank,登錄號為：FJ788387。命名為：MaECM33。
　　 2.根據(jù)MaECM33的cDNA序列推導出一個388個氨基酸的蛋白質(zhì)，推導蛋白理論分子量為40443.0 Da，等電點為5.52。經(jīng)http://www.cbs.dtu.dk/預測，發(fā)現(xiàn)包括起始蛋氨酸在內(nèi)連續(xù)19個氨基酸殘基為信號肽。通過Blast比對分析，表明該基因編碼產(chǎn)物

6、為一種糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(glycosylphos phatidylinositol anchored protein，GPI-AP)。
　　 3.通過菌落原位雜交篩選金龜子綠僵菌基因組文庫，獲得MaECM33基因的DNA序列，將結(jié)構基因序列與cDNA序列用bl2seq軟件進行比對，結(jié)果表明結(jié)構基因含兩個內(nèi)含子，長度分別為58bp和66bp，其中一個內(nèi)含子(969-1035)有典型的GT…AG邊界，而另一內(nèi)含子(73-130

7、)其邊界為TG…GG。
　　 4.Southern雜交表明，MaECM33以單拷貝的形式存在于綠僵菌基因組中。
　　 5.構建了MaECM33基因的RNA干擾載體(pbar-RNAi-gpd-trp-ECM33)，該干擾載體以質(zhì)粒pBTM為基本骨架，在該質(zhì)粒引入一個抗除草劑(ammonium glufosinate)的篩選標記bar基因，在bar終止子的3'端順次插入來自于構巢曲霉的gpdA啟動子和trpC啟動子序列。在

8、兩個啟動子之間是一個多克隆位點(MCS)，用于插入外源目的基因。
　　 6.用基因槍法成功地將MaECM33基因的RNA干擾載體(pbar-RNAi-gpd-trp-ECM33)轉(zhuǎn)化到金龜子綠僵菌中。相比其他轉(zhuǎn)化方法，基因槍法具有轉(zhuǎn)化受體操作迅速、簡單，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定的優(yōu)點。
　　 7.由于干擾載體具有抗除草劑的篩選標記bar基因，將轉(zhuǎn)化后的綠僵菌孢子接種于含有除草劑的查氏培養(yǎng)基上，篩選得到一批轉(zhuǎn)化子，經(jīng)傳代培養(yǎng)