黃芪多糖與白花蛇舌草多糖增強(qiáng)豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗免疫效力及其機(jī)理研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，主要導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙和仔豬的大量死亡。該病至今尚無有效的治療方法，疫苗預(yù)防是主要的措施。疫苗的研究已取得顯著進(jìn)展，世界上商品化的PRRS疫苗有滅活疫苗和弱毒活疫苗兩類。臨床上PRRS疫苗主要存在的問題是：第一

2、，疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)需要較長時(shí)間；其次，PRRSV疫苗并不具備完全的保護(hù)力，尤其是滅活疫苗不能激發(fā)細(xì)胞免疫；第三，PRRSV弱毒疫苗可以在免疫豬體組織中存在幾周時(shí)間，并且從注苗豬向易感豬傳播。因此，應(yīng)用滅活疫苗增強(qiáng)疫苗免疫效力和安全性，研制免疫增強(qiáng)劑來提高PRRS滅活疫苗的免疫效果具有顯著優(yōu)勢(shì)。大量研究表明，黃芪多糖和白花蛇舌草多糖具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，作為免疫增強(qiáng)劑有顯著優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)選取黃芪多糖和白花蛇舌草多糖聯(lián)合PRRS滅活疫苗免疫

3、仔豬，觀察其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)疫苗免疫效果的影響，研究其免疫增強(qiáng)作用和機(jī)理，旨在篩選具有較好免疫增強(qiáng)作用的單味或復(fù)合中藥成分，為研制免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。試驗(yàn)分為以下六部分：
　　 試驗(yàn)Ⅰ、黃芪多糖和白花蛇舌草多糖提取及含量測(cè)定
　　 提取黃芪多糖（APS）和白花蛇舌草多糖（OPS），為下一步研究多糖的活性及篩選具有較好免疫增強(qiáng)作用的單味或復(fù)合中藥成分，本試驗(yàn)進(jìn)行APS和OPS的提取及其含量的測(cè)定。采用水提醇沉法提取多糖，苯酚

4、-硫酸法測(cè)定多糖含量。結(jié)果表明，黃芪多糖和白花蛇舌草多糖的提取率分別為21.69％、13.58％，凈含量分別為44.61％、27.25％。
　　 試驗(yàn)Ⅱ、黃芪多糖和白花蛇舌草多糖的體外篩選試驗(yàn)
　　 本試驗(yàn)通過黃芪多糖和白花蛇舌草多糖對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，篩選具有較好免疫增強(qiáng)作用的單味或復(fù)合中藥成分。采用MTT法比較黃芪多糖、白花蛇舌草多糖以及黃芪多糖聯(lián)合白花蛇舌草多糖直接作用以及協(xié)同ConA或LPS促進(jìn)體外培養(yǎng)

5、小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖作用。結(jié)果表明，APS和OPS均能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，而且APS和OPS在一定濃度既能單獨(dú)又能協(xié)同ConA或LPS刺激淋巴細(xì)胞增殖，OPS作用較強(qiáng)，并且APS和OPS聯(lián)合作用與OPS單獨(dú)作用效果差異不顯著。
　　 試驗(yàn)Ⅲ、黃芪多糖和白花蛇舌草多糖對(duì)PRRS滅活疫苗對(duì)免疫效果的影響
　　 本試驗(yàn)通過觀察PRRS抗體水平的動(dòng)態(tài)變化，研究黃芪多糖和白花蛇舌草多糖與PRRS滅活疫苗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)仔豬免疫效果的影響

6、。20頭（26±1）日齡PRRS檢測(cè)陰性豬隨機(jī)分成5組，所有豬均注射豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗，同時(shí)試驗(yàn)組分別肌肉注射高、中、低劑量白花蛇舌草多糖和黃芪多糖，空白對(duì)照組注射等劑量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。分別在注射疫苗后7、14、24、34、44、54、69 d前腔靜脈采血。ELISA方法測(cè)定抗體。結(jié)果表明，APS和OPS均能提高PRRSV滅活疫苗免疫后小豬血清中抗體水平，促進(jìn)抗體提前達(dá)到峰值，OPS各組抗體水平維持時(shí)間要優(yōu)于對(duì)照

7、組和APS試驗(yàn)組，OPS中劑量組免疫增強(qiáng)作用優(yōu)于低劑量組和高劑量組。
　　 試驗(yàn)Ⅳ、黃芪多糖和白花蛇舌草多糖對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞增殖影響
　　 本試驗(yàn)通過觀察豬外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響，探討黃芪多糖和白花蛇舌草多糖聯(lián)合豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗增強(qiáng)免疫作用機(jī)理。試驗(yàn)動(dòng)物處理同試驗(yàn)Ⅲ.MTT法測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，無論ConA、LPS刺激APS和OPS，還是APS和OPS直接作用均能顯著促外周血淋巴細(xì)胞增殖：OP

8、S中劑量組>OPS高劑量組>APS組>生理鹽水組。
　　 試驗(yàn)V、黃芪多糖和白花蛇舌草多糖對(duì)PRRS滅活疫苗免疫后T細(xì)胞亞群的影響
　　 本試驗(yàn)通過觀察仔豬免疫后T細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化，探討黃芪多糖和白花蛇舌草多糖聯(lián)合豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗增強(qiáng)免疫作用機(jī)理。試驗(yàn)動(dòng)物處理同試驗(yàn)Ⅲ。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)豬外周血CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，APS和OPS均能顯著提高仔豬的CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞

9、的百分?jǐn)?shù)；OPS中劑量組CD4+/CD8+比值極顯著高于生理鹽水和APS組（P<0.01），表明黃芪多糖和白花蛇舌草多糖均能提高機(jī)體細(xì)胞免疫力，但提高機(jī)體免疫力則與劑量有關(guān)。
　　 試驗(yàn)Ⅵ、黃芪多糖和白花蛇舌草多糖對(duì)PRRS滅活疫苗免疫后IL-2和IFN-γ的影響
　　 本試驗(yàn)通過觀察仔豬免疫后IL-2和IFN-γ動(dòng)態(tài)變化水平，探討黃芪多糖和白花蛇舌草多糖聯(lián)合豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗增強(qiáng)免疫作用機(jī)理。試驗(yàn)動(dòng)物處理同試驗(yàn)