蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的分離純化及其性質(zhì)研究.pdf

1、蜜蜂白堊病(Honeybee chalkbrood disease)，是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)引起的蜜蜂幼蟲的真菌傳染病。毒力是決定病原菌侵染力的重要指標(biāo)，病原真菌在侵染機(jī)體過程中所分泌一些能降解體壁或組織的蛋白酶與真菌毒力有密切關(guān)系。有研究已經(jīng)證明絲氨酸蛋白酶是真菌侵染無脊椎動(dòng)物過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，是致病性決定因子。因此，系統(tǒng)研究蜜蜂球囊菌分泌的類絲氨酸蛋白酶，能夠使我們更好的了解真菌入侵機(jī)制，從而為進(jìn)一步防

2、治該病打下基礎(chǔ)。 本文在其他研究者的基礎(chǔ)上建立了一套比較簡便易行、提取效果好、成本較低的從蜜蜂球囊菌發(fā)酵液中純化胞外蛋白酶的流程。從蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的粗酶液中分離出一種類絲氨酸蛋白酶，并對(duì)其理化性質(zhì)作了初步研究。 10株來源不同的蜜蜂球囊菌接種于酪蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，將產(chǎn)酶量較大的菌株ND-2作后期試驗(yàn)菌株。采用正交試驗(yàn)法得出用(NH4)2SO4沉淀法濃縮蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的最終粗提條件為：Tris緩沖液濃度為2

3、0 mmol/L，緩沖液pH值為7.8，(NH4)2SO4濃度為80％。 蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的6天發(fā)酵液經(jīng)80％硫酸銨沉淀，DEAE-Sapharose Fast Flow離子交換層析(0～0.5 mol/L NaCl線性梯度洗脫)，Sephadex G-75凝膠層析，獲得一種類絲氨酸蛋白酶，比活由1.9 U/mg提高到345.7 U/mg，純化倍數(shù)為181.9倍，回收率為5.7％。 提純后的蛋白酶用SDS-PAGE電

4、泳檢測，分子量大約為29.5 kDa，命名為pro-AAND-2。金屬離子及抑制劑對(duì)蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性的影響研究，結(jié)果表明：Cu2+和Fe3+對(duì)蛋白酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用，在Ag+、Cu2+的濃度分別達(dá)到20 mmol/L和50 mmol/L時(shí)均可使蛋白酶的活性完全失去，胰蛋白酶抑制劑PMSF能強(qiáng)烈抑制該酶活性，當(dāng)PMSF濃度為10 mmol/L時(shí)基本檢測不到該酶活性，表明它可能是一種絲氨酸蛋白酶。最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別