抗菌肽LL-37和Misgurin基因合成及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、抗菌肽是存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害，消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類由生物細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的小分子多肽，多具有廣譜的抗菌活性，是生物機(jī)體先天性免疫防御體系的重要組成部分。目前已從包括兩棲動(dòng)物、昆蟲、哺乳動(dòng)物、植物、原核生物中分離到超過2000種具有抗細(xì)菌、真菌和病毒等抗菌活性的抗菌肽。但從生物體提取抗菌肽根本無法滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，而化學(xué)合成抗菌肽又太昂貴。因此利用基因工程的方法將人工合成的抗菌肽基因?qū)胨拗骷?xì)胞，再通過微生物發(fā)酵的

2、方法生產(chǎn)抗菌肽更具實(shí)際意義。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得重組的人源抗菌肽LL-37和來自泥鰍的抗菌肽Misgurin，以期為工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)GenBank中LL-37（P49913）和Misgurin（P81474）中的氨基酸序列，選用酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)相應(yīng)的抗菌肽基因L和M。并在它們的N端都引入了α交配因子信號(hào)肽Kex2酶切位點(diǎn)，以保證表達(dá)的抗菌肽具有天然的N端。C端引入谷氨酰胺以增加抗菌肽的

3、酰胺化程度，增強(qiáng)其抗菌活性。然后分別將抗菌肽基因L和M克隆至酵母分泌型表達(dá)載體pPICZα-A中，構(gòu)建重組真核酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-A-L和pPICZα-A-M。測(cè)序結(jié)果表明，LL-37和Misgurin的基因已正確亞克隆至真核表達(dá)載體pPICZα-A上。
　　 大量提取重組真核表達(dá)載體質(zhì)粒，并以pPICZα-A表達(dá)載體為對(duì)照，經(jīng)SacⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至酵母菌SMD1168株。經(jīng)濃度逐步增加的ZeocinTM抗性YPD

4、S平板篩選獲得高拷貝的陽性重組酵母菌pPICZα-A-L/SMD1168和pPICZα-A-M/SMD1168。在含甘油的BMGY培養(yǎng)基增菌至OD600達(dá)5～6后，轉(zhuǎn)至含有甲醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每隔24h補(bǔ)加100％甲醇使終濃度達(dá)0.5％。采用瓊脂孔擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果顯示重組酵母菌pPICZα-A-L/SMD1168和pPICZα-A-M/SMD1168的表達(dá)上清都具有廣譜抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌Cowan