水稻蛋白酪氨酸磷酸酶基因OsPTP1的分子生物學(xué)研究.pdf

1、非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素，而其中又以干旱、鹽漬和低溫的影響最為嚴(yán)重。植物是如何感受并識別逆境信號，傳遞逆境信息，激活一系列信號分子并調(diào)控相關(guān)基因的表達及生理生化反應(yīng)以維持其正常的生長發(fā)育，即植物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)問題，現(xiàn)已成為生命科學(xué)研究的熱點。在真核生物中，蛋白質(zhì)的“可逆磷酸化”作為一項普遍而重要的調(diào)控機制，幾乎參與調(diào)控著生命活動的每個過程，細(xì)胞的生長和分化、基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)的修飾和代謝調(diào)控、分子識別和信號

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)等都與蛋白質(zhì)的可逆磷酸化密切相關(guān)。隨著蛋白酪氨酸磷酸酶在高等植物中的發(fā)現(xiàn)，它們的功能也受到了科學(xué)家的重視。生化和遺傳分子生物學(xué)的研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶通過調(diào)節(jié)可逆磷酸化過程，在植物逆境信號傳遞中發(fā)揮著重要作用，但是有關(guān)蛋白酪氨酸磷酸酶參與逆境信號傳遞途徑的作用機制尚不明了。
　　 本實驗室在前期研究中，從水稻中克隆到一個蛋白酪氨酸磷酸酶基因(命名為OsPTP1)，其編碼區(qū)長度為666bp，編碼含有222個氨基酸殘基的蛋白

3、質(zhì)。酶活分析表明，該酶屬于酪氨酸特異性磷酸酶。為了進一步明確OsPTP1基因的生物學(xué)功能及其在植物逆境脅迫下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究通過酵母雙雜交及過表達等技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，對該基因的作用機理進行了分析研究。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1.通過生物信息學(xué)的方法，對水稻蛋白酪氨酸磷酸酶基因OsPTP1進行了結(jié)構(gòu)和功能分析。采用TMpred跨膜結(jié)構(gòu)分析軟件，發(fā)現(xiàn)該基因的序列均屬于親水區(qū)，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，可能不定位于膜

4、上，為非受體型PTPases；選取來自不同物種的14個PTPases基因，對其蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域比對結(jié)果表明，其催化結(jié)構(gòu)域高度保守；聚類分析表明OsPTP1基因與來自擬南芥、楊樹、玉米、葡萄、辣椒等植物中的PTPases基因在整個系統(tǒng)進化樹上形成單獨的一枝，且與來自動物界、真菌界的PTPases基因明顯區(qū)分開；
　　 2.利用酵母中與OsPTP1同源基因SIW14的突變體，通過酵母互補的方法對OsPTP1的蛋白磷酸酶功能進行驗證

5、。結(jié)果表明，突變體對高鹽敏感，而轉(zhuǎn)入pYES2-OsPTP1載體的酵母突變體菌株生長狀況得到恢復(fù)；
　　 3.通過半定量RT-PCR技術(shù)分析了水稻中OsPTP1基因的誘導(dǎo)表達情況。結(jié)果顯示，在干旱、ABA、H2O2等三個因素的誘導(dǎo)下，OsPTP1基因均能上調(diào)表達，提示該基因可能參與植物逆境脅迫下的信號通路；
　　 4.將OsPTP1基因轉(zhuǎn)化煙草(NC82)進行過表達，并檢測其逆境脅迫下的表型及生理指標(biāo)的變化情況。結(jié)果表明

6、，在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株的抵抗能力要明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株；較之野生型煙草，OsPTP1過表達煙草葉片萎蔫程度明顯增加，氣孔開放度增大，氣孔孔徑的降低程度也要低于野生型，且葉片中游離脯氨酸的含量顯著提高。在高鹽處理條件下，OsPTP1過表達煙草葉片也表現(xiàn)出一定程度的水漬化、內(nèi)含物流失等現(xiàn)象，而且轉(zhuǎn)基因煙草T0代種子的萌發(fā)率受到高鹽的抑制。但低溫脅迫下，兩者在表型和生理上沒有明顯的區(qū)別，提示OsPTP1基因可能作為一個負(fù)調(diào)控因子，參與植物

7、在干旱、高鹽等逆境脅迫下的信號通路；
　　 5.通過酵母雙雜交系統(tǒng)，成功構(gòu)建了pGBKT7-OsPTP1誘餌載體以及水稻幼苗cDNA文庫，并通過酵母共轉(zhuǎn)化的方法篩選到10余個與OsPTP1相互作用的蛋白。這些蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)錄因子，如MADS-BOX、WRKY等、蛋白激酶、擴張蛋白、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶等，并且對擴張蛋白OsEXPA7與OsPTP1的互作關(guān)系進行了驗證；
　　 6.提出了一個OsPTP1基因參與植物氣孔運動和發(fā)育