雞巨型艾美球蟲(chóng)GAM56基因核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)效果.pdf

1、本研究以GAM56基因?yàn)檠芯繉?duì)象，構(gòu)建了雞球蟲(chóng)核酸疫苗，并通過(guò)雞體試驗(yàn)評(píng)價(jià)了其免疫原性和免疫保護(hù)效果，旨在為其臨床用于雞球蟲(chóng)病的預(yù)防控制提供理論依據(jù)。 1、巨型艾美球蟲(chóng)配子體GAM56基因核酸疫苗的構(gòu)建及鑒定 以含E.maxima NT株配子體基因cDNA片段的質(zhì)粒pGEM-T-gam56 DNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)GAM56基因含ORF的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的1465 bp的片段。將擴(kuò)增的GA

2、M56基因插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，經(jīng)EcoRI和HindIII酶切鑒定和陽(yáng)性重組質(zhì)粒序列測(cè)定證實(shí)，GAM56片段正確的閱讀框架插入了pCDNA3.1的多克隆位點(diǎn)，基因序列未發(fā)生變異。以切膠免疫的鼠源抗GAM56蛋白片段高免血清為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，對(duì)轉(zhuǎn)染GAM56基因的COS-1細(xì)胞中GAM56基因表達(dá)情況進(jìn)行了IFA檢測(cè)。轉(zhuǎn)染后72h，在部分COS-1細(xì)胞胞漿內(nèi)和細(xì)胞膜上均有GAM56基因的表達(dá)

3、，顯現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)，證明所構(gòu)建的核酸疫苗體外在真核細(xì)胞中能正確地表達(dá)GAM56基因。 2、雞巨型艾美球蟲(chóng)配子體GAM56基因核酸疫苗免疫原性的研究 為了探討所構(gòu)建的核酸疫苗是否具有免疫原性，將pcDNA3.1-GAM56質(zhì)粒分別以100μg、50μg、25μg三個(gè)劑量胸肌注射免疫黃羽肉雞，7日齡首免，14日齡時(shí)以相同劑量和途徑加強(qiáng)免疫一次，同時(shí)設(shè)立PBS和空質(zhì)粒對(duì)照組，每組20只雞。分別于7、14、21、28日齡每組隨

4、機(jī)抓取5只，無(wú)菌心臟采血2 mL，進(jìn)行血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和血清特異性抗體的ELISA檢測(cè)，分析其細(xì)胞免疫和體液免疫水平的變化。結(jié)果表明：首免后7d，DNA疫苗各劑量組即能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖水平(P<0.05)，且以pcDNA3.1-GAM56(50μg)中劑量組的淋巴細(xì)胞增殖水平最高，首免后14和21 d，淋巴細(xì)胞增殖水平繼續(xù)提高。利用間接ELISA法測(cè)定抗體水平發(fā)現(xiàn)首免后7d各核酸疫苗免疫組均有特異性抗體產(chǎn)生，其中pcDNA3.

5、1-GAM56(50μg)中劑量組的抗體水平顯著高于其他核酸劑量組(P<0.05)，首免后14和21 d，特異性抗體水平繼續(xù)提高。結(jié)果顯示，該核酸疫苗具有良好的免疫原性。 3、雞巨型艾美球蟲(chóng)配子體GAM56基因核酸疫苗的免疫保護(hù)效果 將pcDNA3.1-GAM56分別以100μg、50μg25μg三個(gè)劑量胸肌注射免疫黃羽肉雞，7日齡首免，14日齡時(shí)以相同劑量和途徑加強(qiáng)免疫_(dá)次，同時(shí)設(shè)立PBS和空質(zhì)粒對(duì)照組，每組10只雞。

6、于21日齡時(shí)，除未免疫未攻蟲(chóng)組每雞經(jīng)嗉囊接種5×104E.maxima NT株孢子化卵囊，7d后稱重?fù)錃?。?duì)各組的存活率、相對(duì)增重率、卵囊減少率等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，就增重而言，在三個(gè)劑量組中，pcDNA3.1-GAM56(50μg)中劑量組的相對(duì)增重率最高，達(dá)89.68％，效果最好；就卵囊產(chǎn)量而言，pcDNA3.1-GAM56(50μg)中劑量組能有效地減少卵囊產(chǎn)量，卵囊減少率最高，為53.66％。以上結(jié)果表