牛疊朊編碼基因缺失突變體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、[目的]疊朊是朊蛋白的橫向同源物，深入了解疊朊的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)揭示朊病毒病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。單克隆抗體是研究蛋白質(zhì)功能的有力工具，本實(shí)驗(yàn)室已制備出多株針對(duì)牛疊朊的單克隆抗體，為充分鑒定這些單克隆抗體針對(duì)的抗原表位，通過(guò)基因克隆表達(dá)的策略獲取牛疊朊基因缺失突變體的重組蛋白，以期為單克隆抗體的表位鑒定提供物質(zhì)材料。 [方法]經(jīng)過(guò)對(duì)牛成熟疊朊編碼基因及預(yù)計(jì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的分析，設(shè)計(jì)表達(dá)9個(gè)缺失突變體的引物。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出

2、疊朊基因的缺失突變體，與pET-30a（+）表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliJM109（DE）3和E.coliBL21（DE）3表達(dá)宿主菌中，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)后，以聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡和間接酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的分子量、相對(duì)表達(dá)量和反應(yīng)原性。 [結(jié)果]重組質(zhì)粒的雙酶切和測(cè)序結(jié)果表明，牛疊朊基因的9個(gè)缺失突變均被正確插入pET-30a

3、（+）表達(dá)載體中。聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡和間接酶聯(lián)免疫吸附分析檢測(cè)結(jié)果表明，有6個(gè)缺失突變體被大腸稈菌高效表達(dá)，它們分別是：boDPL（61-124），boDPL（72-155），boDPL（87-155），boDPL（58-155），boDPL（27-144），boDPL（27-155）。其余3個(gè)缺失突變體重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件還有待進(jìn)一步的摸索。 [結(jié)論]成功構(gòu)建了9個(gè)牛疊朊編碼基因的缺失突變體，通過(guò)IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)