牛睪丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、以牛睪丸為材料，通過0.01mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5，內(nèi)含0.2mol/L NaCl)抽提、硫酸銨分級(jí)分離獲得粗酶，通過DEAE-Cellulose(DEAE-32)陰離子交換柱、Sephacry S-300凝膠過濾柱層析2次層析純化，獲得比活力為658.21 U·mg1的聚丙烯酰胺凝膠電泳單一純N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制劑(NAGase，EC3.3.1.52)。測得酶的等電點(diǎn)為5.54，分子量約為68.3

2、 kDa，每個(gè)酶蛋白分子含有364個(gè)氨基酸殘基，其中非極性占35.2％，堿性占16.4％，酸性占24.2％；極性不帶電荷的占24.2％。該酶為單亞基酶，肽鏈內(nèi)含有二硫鍵。該酶為糖蛋白，其中含糖量為3.03％(W/W)。以對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)為底物，測得該酶在0.2mol/L磷酸緩沖液(pH5.6)中催化水解pNP-NAG的最適pH為5.6，最適溫度為50℃。該酶在pH3.0～6.6區(qū)域較穩(wěn)定；在55℃

3、以下處理30 min，酶活力保持穩(wěn)定。在pH5.6的條件下，酶水解pNP-NAG的米氏常數(shù)Km為0.71mmol·L-1，最大反應(yīng)速度Vm為16.716μmol·L-1·min-1，酶催化pNP-NAG反應(yīng)的活化能Ea為64.19kJ·mol-1。 金屬離子對(duì)牛睪丸NAGase活力影響的研究表明：Na+在低濃度(0～10mmol/L)下對(duì)酶的活力沒有影響，在高濃度(0～1.0mol/L)下， Na+對(duì)酶有微弱的抑制作用。Cu2+

4、對(duì)酶有微弱的抑制作用。Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+對(duì)酶有不較強(qiáng)的抑制作用。Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+對(duì)酶的抑制表現(xiàn)均為可逆非競爭性抑制機(jī)制，Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+對(duì)酶的抑制常數(shù)KI分別為75.26mmol·L-1、87.37 mmol·L-1、2.21 mmol·L-1和41.18 mmol·L-1。 研究15種氨基酸對(duì)牛睪丸NAGase活力影響的結(jié)果表明：在特定濃度范圍內(nèi)，L-Ile、L-

5、Met，L-Phe、L-Ala，L-Leu，L-Pro等非極性氨基酸對(duì)牛睪丸NAGase的活力沒有顯著影響， L-Thr、L-Gly、L-Gln、L-Ser、L-Asn、L-His等極性氨基酸對(duì)酶活力也沒有顯著影響，L-Val對(duì)酶活力有微弱的激活作用，L-Arg、L-Lys對(duì)牛睪丸NAGase有不同程度的抑制作用。L-Arg對(duì)酶的抑制表現(xiàn)為可逆非競爭性機(jī)制，L-Arg的KI為24.22 mmol·L-1。L-Lys對(duì)酶的抑制表現(xiàn)為可逆反