芐嘧磺隆降解菌的分離鑒定特性研究及生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、本論文主要以浙江大學(xué)華家池校區(qū)農(nóng)場淹水稻田土壤為研究材料,以我國水稻田中廣泛使用的磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆為主要研究對象,篩選分離到幾株芐嘧磺隆降解菌株,并對降解菌株的生長及降解特性進行了初步探討;綜合運用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法及現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,采用室內(nèi)培養(yǎng)、純培養(yǎng)及統(tǒng)計分析相結(jié)合的方法,全面探討了磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆對淹水稻田土壤可培養(yǎng)微生物種群數(shù)量、土壤酶活性、土壤呼吸以及微生物生態(tài)的毒性效應(yīng),為建立有效的除草劑污染預(yù)警指標體系、環(huán)境質(zhì)量

2、評價及芐嘧磺隆降解菌株的有效利用提供了有益參考。本研究主要結(jié)果如下： 1、從供試土樣中共分離純化得到4株芐嘧磺隆降解效率較高的菌株,將其中1株降解效率最高的芐嘧磺隆降解菌株編號為D5。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化分析、G+C mol％、16S rDNA序列同源性比較和Biolog碳源利用分析,初步鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌菌株(Bacillus　megaterium)。其它3株芐嘧磺隆降解菌株A2、B2和D2分別與三氯乙烯降解菌株Rhod

3、ococcus sp.L4、類短短芽孢桿菌Brevibacillus parabrevis IFO 12334T和苯胺降解菌株Rhodococcus sp.AN-22的相似度最高,分別達到99.7％、100％和100％。 菌株D5能較好利用芐嘧磺隆、綠磺隆、氯嘧磺隆和嘧磺隆等四種磺酰脲類除草劑；能很好利用苯、葸酮、三唑磷、敵敵畏和樂果；可以利用二甲苯、硝基苯、對苯二胺、間苯二酚、鄰苯二酚、苯酚、敵百蟲、毒死蜱和喹硫磷：不能利用萘

4、、甲苯和十溴聯(lián)苯醚?？梢?D5既可以利用磺酰脲類除草劑,又可以利用有機磷農(nóng)藥和部分芳香族化合物?？蔀槎喙δ芫?菌群)的研究提供良好材料,有一定的研究價值?？姑粜越Y(jié)果表明,菌株D5對設(shè)定濃度范圍內(nèi)的所有供試抗生素都很敏感,對青霉素鈉、氨芐青霉素、先鋒霉素V和VI尤為敏感,均產(chǎn)生較大的抑菌圈。 芐嘧磺隆降解菌株D5在pH 6.5-9的范圍內(nèi)均可以生長,以在pH 7.5時生長最佳；菌株D5在10-40℃的溫度范圍內(nèi)均可以生長,30℃是

5、最佳生長溫度；芐嘧磺隆濃度對菌株D5的生長有一定的影響,50 mg L-1時菌株D5生長最好；裝液量為25-150 ml(250 ml三角瓶),菌株D5均可以生長,通氣量為1/5體積時菌株生長狀況最好；M2+濃度為100-500 mg L-1的范圍內(nèi),菌株均可以生長,以Mg2+濃度為400 mg L-1時菌株D5的生長最佳。分別以酵母膏為唯一碳源和以葡萄糖為唯一氮源時,菌株D5生長最好。 菌株D5純培養(yǎng)和四株降解菌株混培對整體生

6、物量的影響不同。pH 7.5和30℃時,芐嘧磺隆降解效果最好。液體培養(yǎng)基中84 h芐嘧磺隆的降解達到97.7％。說明菌株D5具有較好的降解能力。對添加降解菌株D5以及D5和BH混合菌劑后的芐嘧磺隆降解動力學(xué)進行研究發(fā)現(xiàn)：整個取樣過程中,不同濃度的芐嘧磺隆均有一定程度的降解,降解情況取決于施用的芐嘧磺隆濃度。降解菌劑的加入對芐嘧磺隆在淹水稻田土壤中的降解有一定的促進作用,以只加降解菌株D5菌劑的降解效果為佳。模擬田間淹水稻田土壤中42 d

7、時,芐嘧磺隆的降解達到94.3％,其中微生物降解達到32.5％,而試驗過程中降解菌株細胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定,未發(fā)現(xiàn)其它污染微生物的存在,說明菌株D5在整個降解過程中起到積極作用。進一步證明了淹水稻田土樣中利用微生物對芐嘧磺隆污染土壤進行生物修復(fù)的可能性?；旌暇鷦λ姆N除草劑均有較好的降解效果。 芐嘧磺隆誘導(dǎo)后的菌株全細胞蛋白電泳顯示出特異性條帶,說明該條帶可能是與芐嘧磺隆的降解或解毒有關(guān)的蛋白。紫外誘變方法篩選到降解特性可以穩(wěn)定遺

8、傳的突變體6。 2、采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究不同濃度芐嘧磺隆的施用對淹水稻田土壤可培養(yǎng)微生物(好氧細菌、真菌、放線菌、固氮細菌、氨化細菌、纖維素分解菌、硫化細菌以及厭氧固氮細菌和反硫化細菌)種群數(shù)量、土壤呼吸和土壤酶(過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和多酚氧化酶)活性的影響。結(jié)果表明：恒溫培養(yǎng)條件下,不同濃度芐嘧磺隆的施用對淹水稻田土壤微生物種群數(shù)量、土壤呼吸強度和土壤酶活性有不同影響。 芐嘧磺隆的施用能夠影響淹水稻田土壤可培養(yǎng)微生

9、物的生長,影響程度取決于芐嘧磺隆的施用劑量。低濃度芐嘧磺隆顯著刺激纖維素分解菌和硫化細菌的生長(P<0.05;P<0.05)。14 d時,0.067和0.335 μg g-1干土的芐嘧磺隆處理土樣中的放線菌數(shù)量顯著高于對照水平；7 d和14 d時,0.067和0.335μg g-1干土的芐嘧磺隆處理土樣中氨化細菌數(shù)量顯著高于對照水平；21d和28 d下降到低于對照水平。高劑量(3.553μg g-1干土)的芐嘧磺隆對好氧異養(yǎng)細菌(AHB

10、)、放線菌、好氧固氮菌、氨化細菌和纖維素分解菌的生長均有強烈的抑制作用。盡管芐嘧磺隆在培養(yǎng)初期對處理土樣中的可培養(yǎng)微生物的生長有一定的影響作用,但是,除AHB和好氧纖維素分解菌外,這種影響都不是持久性的。因此,低劑量芐嘧磺隆對土壤可培養(yǎng)微生物種群安全,而高劑量的芐嘧磺隆對土壤可培養(yǎng)微生物種群數(shù)量有一定的消極影響。 芐嘧磺隆施用初期能刺激土壤呼吸強度,隨后產(chǎn)生輕微的抑制作用,這種抑制作用在取樣后期逐漸減輕并趨于對照水平。芐嘧磺隆能

11、輕微刺激過氧化氫酶活性,而蔗糖酶活性基本不受芐嘧磺隆施用量的影響,脲酶活性則是先刺激后抑制,多酚氧化酶活性受芐嘧磺隆影響不大。說明施用一定量的芐嘧磺隆對淹水稻田土壤生態(tài)環(huán)境是安全的。 3、在傳統(tǒng)微生物污染生態(tài)研究基礎(chǔ)上,運用現(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)手段,獲得可用于高效擴增16S rDNA的V3可變區(qū)的直接提取的高質(zhì)量土壤總DNA,并采用DGGE分子指紋技術(shù),對芐嘧磺隆污染條件下淹水稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化進行了初步探討。通過DGGE圖譜

12、分析發(fā)現(xiàn),芐嘧磺隆的施用對淹水稻田土壤微生物種群結(jié)構(gòu)有一定的影響,處理第4周,這種影響有所減弱,對照土樣和芐嘧磺隆處理土樣中微生物群落多樣性差異較?。惶幚淼?周,對照土樣和芐嘧磺隆處理土樣中微生物群落多樣性差異進一步減小,幾乎相同。從處理1-5周土樣的DGGE圖譜中還可以發(fā)現(xiàn),低濃度芐嘧磺隆處理土樣中微生物群落結(jié)構(gòu)之間差異較小,可近似認為低濃度芐嘧磺隆對淹水稻田土壤微生物是安全的,這與前面兩章對土壤可培養(yǎng)微生物和土壤酶活性以及土壤呼吸的

13、研究所得出的結(jié)論一致。芐嘧磺隆是一種相對比較安全的除草劑,可以大力推廣在田間使用。芐嘧磺隆降解菌D5菌劑的添加能夠緩解芐嘧磺隆的負面效應(yīng),刺激其它細菌的生長,使土樣微生物基因多樣性提高。處理土樣中,不同取樣時間微生物群落結(jié)構(gòu)之間存在著顯著的差異：不同取樣時間DGGE電泳條帶有增有減,特征條帶(敏感微生物)亮度很強。本研究是一個新的嘗試,即添加芐嘧磺隆降解菌株來修復(fù)芐嘧磺隆污染的土壤。 4、以大腸桿菌(Escherichia co

14、li)K12、枯草芽孢桿菌(Bacillus subfilis)B19等土壤典型微生物及芐嘧磺隆降解菌(Bacillus megaterium)D5為試驗材料,通過對土壤典型微生物和芐嘧磺隆降解菌株的生長、活性、應(yīng)激反應(yīng)以及生化指標方面的影響研究,初步探討了芐嘧磺隆脅迫對微生物純培養(yǎng)的生理毒性。結(jié)果如下：加入不同濃度芐嘧磺隆的培養(yǎng)基中,兩種G+細菌和一種G-細菌均表現(xiàn)出SOD、CAT和ATPase的活性。說明芐嘧磺隆對三種供試細菌均有一

15、定程度的誘導(dǎo)作用。但對芐嘧磺隆降解菌株D5的誘導(dǎo)作用弱于其他2種非芐嘧磺隆降解菌株,這可能與降解菌株D5能降解芐嘧磺隆有關(guān)。SOD和CAT活性的增加是機體對抗氧化脅迫的一種適應(yīng)性變化,而ATPase在細菌抗氧化脅迫過程中也發(fā)生一系列變化,從而使得將微生物體內(nèi)SOD、CAT和ATPase活性作為環(huán)境受到污染脅迫的分子指標具有一定可行性?；钚匀旧珬l帶的變化可能是由于菌株SOD的表達量不同或芐嘧磺隆對SOD的組成產(chǎn)生了某種影響。有關(guān)結(jié)論需要進