豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離鑒定及其ORF2基因的克隆與表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科圓、環(huán)病毒屬成員，可分為PCV1和PCV2兩個(gè)血清型。PCV1無致病性，廣泛存在于豬體及豬源細(xì)胞系內(nèi)；PCV2有致病性，是引起斷乳豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病原之一。PMWS是繼繁殖與呼吸綜合征之后出現(xiàn)的又一豬免疫抑制性疾病，自1991年加拿大首次報(bào)道以來，PMWS迅速在許多國家發(fā)生流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已引起世界各國的廣泛重視，我國也有PMWS流

2、行和病毒分離的報(bào)道。PCV2除引起PMWS，還與豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性腦震顫(CT)等相關(guān)，PCV2的感染已嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。據(jù)臨床報(bào)告及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，山東省也有一定量PCV2感染，并對(duì)實(shí)際生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。為了進(jìn)一步了解PCV2在山東省的流行、致病情況，并進(jìn)一步建立對(duì)其感染的快速診斷與檢疫方法，為規(guī)?；i場(chǎng)PCV2的診斷、防治提供科學(xué)依據(jù)，我們開展了相關(guān)研究。 1.豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離、鑒定及

3、其ORF2基因序列分析 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus，PCV)基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCV2特異性引物。對(duì)山東省部分豬場(chǎng)的疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的8個(gè)自然病例的淋巴結(jié)、脾臟組織進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)到陽性病料2份，檢測(cè)陽性率為25％，說明該病在山東省已經(jīng)存在。將檢測(cè)陽性的病料組織研磨、離心、過濾除菌，接種到無PCV污染的。PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。病毒在PK-15細(xì)胞

4、上盲傳4代后，提取病毒DNA，利用PCV2特異性引物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得陽性結(jié)果，表明PCV2在無PCV污染的PK-15細(xì)胞中增殖培養(yǎng)成功。將PK-15細(xì)胞增殖所得的病毒樣品處理，在電鏡下可觀察到直徑約為17nm的圓形病毒樣粒子。間接免疫熒光試驗(yàn)可觀察到PCV2特異性免疫熒光。由此說明，分離出的病毒為豬圓環(huán)病毒2型，并命名為PCV2 SD01和SD02株。 根據(jù)已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF2的基因序列，設(shè)

5、計(jì)一對(duì)PCV2的ORF2基因特異性引物，以病料組織和病毒的細(xì)胞DNA為模板，對(duì)PCV2的ORF2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)一條大小約0.7 kb的特異性目的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符。利用DNA凝膠快速回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收、測(cè)序，結(jié)果表明：PCV2SD01和SD02株的ORF2基因序列均由702bp組成，通過比較發(fā)現(xiàn)，分離的SD01和SD02株ORF2基因同源性為99.9％，與其他PCV2毒株ORF2

6、基因的同源性為91.9％-99.4％。 2.豬圓環(huán)病毒2型山東株ORF2基因的原核表達(dá) 根據(jù)基因分析，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從克隆的pMD-ORF2重組質(zhì)粒擴(kuò)增出大小為585bp的部分ORF2基因片段(ORFs)，，克隆到pMD-18T載體中，之后轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET-32a，經(jīng)Sail和Xhol酶切鑒定，得到陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-QRFs。將重組質(zhì)粒pET-ORFs轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21中，經(jīng)終濃度為1mmol/L的IPTG

7、誘導(dǎo)，成功表達(dá)了ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白。經(jīng)Western-Blot檢測(cè)表明，表達(dá)的重組蛋白能夠被PCV2陽性血清所識(shí)別，由此說明，重組表達(dá)的PCV2部分ORF2蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 豬圓環(huán)病毒2型山東株的分離鑒定、ORF2序列分析，為進(jìn)一步開展豬圓環(huán)病毒病的病原學(xué)、診斷和防制研究莫定了基礎(chǔ)，也為下一步開展的ORF2基因編碼蛋白的生物活性及建立PCV2診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)；豬圓環(huán)病毒2型山東株ORF2基因的原核表達(dá)的研究，