花生脂肪酸代謝關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、花生是我國(guó)主要油料作物，其總產(chǎn)居各油料作物之首，花生品質(zhì)改良育種對(duì)我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。傳統(tǒng)的育種技術(shù)周期長(zhǎng)，特定成分提高幅度有限，農(nóng)藝性狀難以綜合?；蚬こ虨樽魑锲贩N遺傳改良提供了一個(gè)高效的技術(shù)手段，可以大大縮短育種周期和提高育種效率。因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)花生脂肪酸組分改良具有重要理論與實(shí)踐意義。 本研究以花生品種E12幼苗為材料提取總RNA，并分離mRNA，利用SMART(Switching Mechanism a

2、t5'end of RNA Transcript)技術(shù)合成雙鏈cDNA。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sfi I酶切，將經(jīng)過分級(jí)分離得到的cDNA連接到改造的質(zhì)粒載體pBluescriptIISK，構(gòu)建了花生幼苗cDNA文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè)，所構(gòu)建文庫(kù)的滴度為1.1×106cfu/mL，重組率為93.4％，插入片段大小為750～2000bp。利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得大批高質(zhì)量序列，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行Unigene歸并和序列注釋分析，得到了4074條Unige

3、nes，其中3897條序列有相關(guān)同源信息。 從構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中獲得了兩個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，簡(jiǎn)稱PEPC)基因片段(編號(hào)為HS096-h02和HS092-d05)，通過RACE和RT-PCR方法，獲得兩個(gè)花生PEPC基因序列，分別命名為AhPEPC1(GenBank登錄號(hào)：EU391629)和AhPEPC2(GenBank登錄號(hào)：FJ222240)；同時(shí)，根

4、據(jù)公布的擬南芥PEPC基因家族的4個(gè)基因和大豆PEPC基因家族的5個(gè)基因，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RACE技術(shù)結(jié)合RT-PCR方法，從花生中分離了另外三個(gè)PEPC基因，分別命名為AhPEPC3(GenBank登錄號(hào)：FJ222826)，AhPEPC4(GenBank登錄號(hào)：FJ222827)和AhPEPC5(GenBank登錄號(hào)：FJ222828)。AhPEPC1-5基因開放閱讀框長(zhǎng)度為2，907bp，2，901bp，2，901bp，2，91

5、0bp和3，111bp；分別編碼968，966，966，969和1036個(gè)氨基酸殘基。熒光定量PCR結(jié)果顯示，花生AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3、AhPEPC4和AhPEPC55個(gè)基因在普通花生和高油分花生品種的四種不同組織(根、莖、葉和種子)中都有表達(dá)，表達(dá)模式各不相同。除AhPEPC2外，AhPEPC1、AhPEPC3、AhPEPC4、AhPEPC5四個(gè)基因在普通花生中的表達(dá)量均顯著高于高油分花生品種。 從構(gòu)

6、建的cDNA文庫(kù)中還獲得了一個(gè)花生β-酮脂酰-ACP合成酶II(beta-ketoacyl-ACP synthetase II，簡(jiǎn)稱KAS II)基因和一個(gè)硬脂酰-載體蛋白去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，簡(jiǎn)稱SAD)基因的部分序列(編號(hào)為HS137 H08)，以此為基礎(chǔ)，利用RACE方法擴(kuò)增得到包含這兩個(gè)基因完整編碼區(qū)的cDNA序列，分別命名為AhKAS II(GenBank登錄號(hào)：FJ358425)和AhSA

7、D(GenBank登錄號(hào)：FJ230310)。獲得的AhKAS II序列長(zhǎng)度為1867bp，編碼404個(gè)氨基酸；AhSAD序列長(zhǎng)度為1499bp，編碼406個(gè)氨基酸。采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)這兩個(gè)基因在不同花生品種、不同花生組織(根、莖、葉和種子)中的表達(dá)分別進(jìn)行研究，結(jié)果表明這兩個(gè)基因在花生不同組織中的表達(dá)差異都十分顯著，AhKAS II基因在種子中的表達(dá)最為突出，AhSAD在種子和葉中的表達(dá)量最高，推測(cè)這兩個(gè)基因可能在植物種子的生長(zhǎng)

8、發(fā)育過程中起重要的作用，另外不同花生品種間的基因表達(dá)量也存在差異。 利用生物信息學(xué)方法，從普通花生和高油酸花生品種中分別獲得了△12脂肪酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為AhFAD2B和AhFAD2B'。分析兩個(gè)基因的編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)，AhFAD2B'基因序列在起始密碼子后第442 bp處有堿基A的插入，導(dǎo)致編碼區(qū)提前終止，編碼一個(gè)截短蛋白AhFAD2B'，丟失了一個(gè)膜結(jié)合蛋白保守的組氨酸框。表達(dá)分析顯示，AhFAD2B在