豬肺炎支原體熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起豬氣喘病(Mycoplasma pneumoniae of swine，MPS)的主要病原，也是豬呼吸道綜合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）的主要原發(fā)性病原之一。MPS是一種慢性的、傳播性強(qiáng)的且在世界各地廣泛分布的疾病，主要導(dǎo)致患豬生長(zhǎng)緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率低并常常引起其他病原的繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。

2、針對(duì)MPS的診斷方法，包括臨床診斷、病理組織學(xué)診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷方面的診斷方法，目前Mhp的診斷主要方法有分離培養(yǎng)法、免疫熒光法、核酸探針?lè)ㄒ约熬酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)等，在當(dāng)今規(guī)?；i場(chǎng)中，豬感染后多呈慢性或隱性感染，這些方法雖然可以對(duì)病原做出診斷，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、代價(jià)高、敏感性和特異性不夠理想等缺點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)豬肺炎支原體并對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行精確定量

3、的研究，但對(duì)以TaqMan熒光定量PCR定性定量檢測(cè)Mhp的研究還比較少。
　　 目前研究較多的的豬肺炎支原體蛋白基因有P36、P46、P65、P97等，基于纖毛粘附因子P97是Mhp引起豬地方性肺炎的主要蛋白因子，本研究根據(jù)GenBank公布的Mhp P97基因序列，設(shè)計(jì)合成了特異性引物，PCR擴(kuò)增Mhp168株的P97基因序列，克隆入pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T/P97，經(jīng)測(cè)序鑒定為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒。根據(jù)陽(yáng)性質(zhì)

4、粒的拷貝數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對(duì)數(shù)與C值之間的線性關(guān)系方程為Y(Ct)=-3.41X+42.549;在國(guó)內(nèi)首先建立了以P97為靶基因序列的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。通過(guò)測(cè)定Mhp菌液拷貝數(shù)后，將Mhp DNA進(jìn)行10倍比稀釋，以此來(lái)檢測(cè)TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性，敏感性達(dá)8.3 copy/μL;通過(guò)與其他菌株進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增比較，Mhp與其它病原無(wú)交叉感染，特異性良好;稀釋后以不同濃

5、度的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，重復(fù)性良好，此方法可用于豬肺炎支原體培養(yǎng)物和組織樣品的快速定量檢測(cè)。
　　 在此基礎(chǔ)上，將TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，通過(guò)定量檢測(cè)滅活前后豬肺炎支原體疫苗中Mhp基因含量，發(fā)現(xiàn)Mhp含量無(wú)顯著變化，說(shuō)明滅活不影響疫苗中Mhp基因含量;通過(guò)檢測(cè)豬肺炎支原體在攻毒豬體內(nèi)各組織的分布，發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體在呼吸器官含量最多，約為106 copy/μL，而在其他組織分布較少，如在小腸、

6、肌肉、腦、肝、心等組織中含量約為102 copy/μL甚至更少，在腎、淋巴結(jié)中則無(wú);采取43份豬肺組織，比較熒光定量PCR檢測(cè)法與套式PCR檢測(cè)法檢測(cè)效果，熒光定量PCR檢出率100％，套式PCR檢出率為79％，驗(yàn)證了本試驗(yàn)中所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法敏感性高于套式PCR;通過(guò)檢測(cè)豬場(chǎng)病變豬肺組織中Mhp含量變化，可了解整個(gè)豬場(chǎng)感染Mhp的情況。
　　 這些均驗(yàn)證了所建立的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)豬肺炎支原體方法能較好