抗HBsAg雞卵黃抗體的制備及HBsAg夾心ELISA檢測方法的初步建立.pdf

1、乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的一種嚴(yán)重影響人類健康的傳染病，且慢性乙型肝炎病毒感染是一個(gè)困擾全球的健康問題。臨床上對乙型肝炎的診斷有多種方法，主要是通過血清學(xué)方法對HBV初步診斷，其中包括酶免疫法、放免法、化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法等，目前應(yīng)用較廣、較普及的是酶免疫法。然而，乙肝酶免檢測試劑盒中檢測抗體均為哺乳動(dòng)物抗體，而且哺乳動(dòng)物IgG能與人血清中Fc受體、類風(fēng)濕因子和蛋白激酶A/G等發(fā)生非特異性

2、反應(yīng)，并能激活哺乳動(dòng)物補(bǔ)體，從而增加假陽性反應(yīng)，使檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，開發(fā)新的HBV檢測方法勢在必行。本研究用乙肝病毒表面抗原(HBsAg)免疫產(chǎn)蛋雞，獲得抗HBsAg特異性雞卵黃免疫球蛋白(IgY)，并對其進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記，作為夾心ELISA的檢測抗體，初步建立檢測HBsAg的雙抗體夾心ELISA方法。
　　 首先，本試驗(yàn)以HBsAg作為免疫原，免疫100日齡的羅曼氏產(chǎn)蛋雞，當(dāng)在卵黃液中產(chǎn)生較高滴度特異性抗HBsAgI

3、gY抗體時(shí)，收集高免雞蛋進(jìn)行卵黃抗體的分離純化。以免疫當(dāng)天為0天，分別在免疫后2周和6周后各加強(qiáng)免疫1次，共免疫三次，免疫均采用雞胸部肌肉多點(diǎn)注射，首次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑，每次免疫0.5mLHBsAg疫苗(含HBsAg20μg)/只。在免疫前3天收集雞蛋作為對照，免疫期間每天收集雞蛋于4℃保存?zhèn)溆谩⑺占呙怆u蛋卵黃液用pH=5的鹽酸水溶液稀釋10倍，靜置6小時(shí)后4℃離心，取上清液，分別用55％和33％的

4、飽和(NH4)2SO4溶液進(jìn)行鹽析，粗提后的組分經(jīng)SephadexG-150凝膠柱層析。使用含有0.14mol/LNaCl、0.02mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=7.0)作為洗脫劑，流速為22滴/分鐘，上樣量為1ml，分段收集，取第一個(gè)峰的樣品。經(jīng)分光光度法和SDS-PAGE測定制備的IgY樣品，結(jié)果表明，所得樣品可溶性蛋白含量為0.72mg/mL卵黃、平均相對分子質(zhì)量約為165KD。用間接ELISA法測定制備

5、的IgY樣品的抗體滴度為1:12800。
　　 然后，試驗(yàn)經(jīng)改良過碘酸鈉氧化法，用HRP(辣根過氧化物酶)對抗HBsAg雞卵黃抗體進(jìn)行標(biāo)記，得到標(biāo)記物HRP含量為0.24mg/mL,IgY含量為0.54mg/mL,克分子比值為1.76，標(biāo)記率為54.31％。用直接ELISA法測定HRP標(biāo)記的抗HBsAgIgY抗體滴度為1:400。本研究利用抗HBsAg的單克隆抗體作為包被抗體和HRP標(biāo)記的抗HBsAg雞卵黃抗體作為捕獲抗體，初步

6、建立了檢測HBsAg的雙抗體夾心ELISA方法，并對其反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如下：(1)方陣滴定實(shí)驗(yàn)確定捕獲抗體的最佳濃度為1:4000，檢測抗體的工作濃度為1:50；(2)4℃包被過夜；(3)封閉液采用1％脫脂奶粉-PBST；(4)以1％脫脂奶粉-PBST-4％PEG6000作為酶標(biāo)抗體稀釋液；(5)底物最佳作用時(shí)間為室溫15分鐘。并對建立的雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，檢測靈敏度為2.5ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)為4.72

7、％，批間變異系數(shù)為13.14％，與鴨病毒性肝炎病毒作交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，表明該ELISA方法特異性(10％)好。應(yīng)用本研究建立的雙抗體夾心ELISA檢測43份人血清樣本，與市售試劑盒測定結(jié)果一致。
　　 上述結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功地用水稀釋-兩步鹽析-凝膠過濾法制備了較高純度的抗HBsAg雞卵黃抗體，并用HRP對其進(jìn)行標(biāo)記，初步建立了檢測HBsAg的雙抗體夾心ELISA方法，為HBV檢測的研究提供新的方法和思路，為人類及哺乳動(dòng)物疾病的診