上海地區(qū)豬鏈球菌2型的流行病學(xué)調(diào)查及其PGK基因缺失株的構(gòu)建.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一種重要人獸共患病，尤其是豬鏈球菌2型，不僅對豬的致病性強(qiáng)，而目還可感染特定的人群，甚至致死，給養(yǎng)豬業(yè)和人類公共衛(wèi)生造成巨大影響。但迄今為止，其致病機(jī)制尚不十分明確。因此，本研究在流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性分析的基礎(chǔ)上，擬通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建基因缺失株，為進(jìn)一步研究豬鏈球菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本文主要開展了下列研究：
　　研究采集臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型感染豬的全血、內(nèi)臟器官及糞便，進(jìn)行細(xì)菌的分離純化，運(yùn)用雙

2、重PCR法鑒定，根據(jù)檢測結(jié)果選取所有毒力因子陽性的2型菌株，應(yīng)用SPF巴馬小型豬作為動(dòng)物模型進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)，篩選出強(qiáng)毒株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可用的強(qiáng)毒株。最后用紙片擴(kuò)散法對臨床分離到的豬鏈球菌2型菌株測定其耐藥性。
　　本實(shí)驗(yàn)采用同源重組的原理，將PGK基因上下游各500 bp和800 bp左右的兩側(cè)序列以及Cm抗性基因分別克隆到質(zhì)粒載體PUCl8上，兩側(cè)序列作為同源臂。用EcoR I/Sph I酶切pUCl8-PsCmPa和穿梭載體

3、pSET4s，回收連接片段，將回收所得的片段定向插入到經(jīng)同樣的內(nèi)切酶雙酶切處理過的溫敏型質(zhì)粒 pSET4s，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到SH08感受態(tài)細(xì)胞中，在經(jīng)過28℃復(fù)蘇和37℃質(zhì)粒丟失后，利用PCR法和抗性篩選基因缺失株。
　　結(jié)果顯示在116份樣品中檢測到31株豬鏈球菌2型，對9種藥物耐藥率為AM：80％、GM：68%、CHL：84%、SXT：52%、CIP：55%、ERY：22.6%、TCY：38.7

4、%、STR：6.5%、PEN：16.1%。試驗(yàn)結(jié)果表明分離的31株2型豬源性鏈球菌，均為多重耐藥株，且AM的耐藥性最為嚴(yán)重。同時(shí)篩選到了強(qiáng)毒株SH08，在最佳電轉(zhuǎn)條件：電壓2.25KV，電容25μF，脈沖電阻500Ω下成功構(gòu)建了PGK基因缺失株。
　　綜上所述，豬鏈球菌2型病仍是威脅上海地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，且病原較為復(fù)雜，耐藥性的產(chǎn)生也給藥物治療帶來越來越多的困難，尤其是對臨床首選藥AM、GM及 PEN也產(chǎn)生不同程度耐藥性