沙田柚自交不親和分子機理研究.pdf

1、沙田柚是我國傳統(tǒng)優(yōu)良柚品種，種植面積較大，由于其具有自交不親和特性，在生產(chǎn)中需合理配置授粉樹或人工授粉，費時費力?，F(xiàn)實中由于柑橘屬中許多品種具有很強的單性結(jié)實能力，如果這些品種同時伴有自交不親和特性，生產(chǎn)中不僅無需配置授粉樹，而且獲得的是無籽果實，這也正是柑橘育種者一直努力追求的目標之一。因此探究柚類植物自交不親和內(nèi)在機制具有重要的理論和實際意義。近些年關(guān)于植物自交不親和機理研究雖然在十字花科、薔薇科、玄參科以及罌粟科等物種上取得了顯著

2、進展，然而關(guān)于沙田柚等柑橘屬植物自交不親和研究僅僅還處于起步階段，其內(nèi)在可能的遺傳及分子調(diào)節(jié)機制至今不明，尤其是控制其自交不親和特性的關(guān)鍵基因，如雌蕊決定因子、花粉決定因子至今還未被克隆。本研究選取自交親和突變材料秭歸沙田柚為試驗材料，以對應(yīng)的自交不親和材料廣西沙田柚材料為參照，開展如下工作:
　　1)形態(tài)學比較結(jié)果顯示，秭歸沙田柚與廣西沙田柚在葉型指數(shù)氣孔密度等指標并無差別，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示兩材料同為二倍體植株，并且雌雄蕊

3、發(fā)育都正常。自交不親和材料的廣西沙田柚自交授粉后花粉管在花柱中上部被抑制，花粉管不能穿透花柱進入子房，而自交親和材料秭歸沙田柚自交授粉后花粉管可以正常萌發(fā)生長并且穿過花柱進入子房發(fā)生授粉受精。進一步觀察表明在秭歸沙田柚自交授粉后35天合子胚發(fā)育出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致種子敗育。
　　2)利用秭歸沙田柚七個不同發(fā)育時期的花為材料，構(gòu)建柚cDNA全長文庫，將文庫陽性克隆測序，共計獲得3962條有效序列經(jīng)序列拼接，去除冗余，最終獲得2228條

4、高質(zhì)量的柚花器官Unigene，其中包含451條片段重疊序列以及1777條單一序列。將所獲得的柚花器官Unigene經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，1266條可以找到對應(yīng)的同源序列基因注釋，其中891條序列具有一個以上注釋信息。經(jīng)GO功能注釋，760個基因參與分子功能，1189個基因參與生物進程，1154個基因參與細胞組成。在有注釋信息的柚Unigene中包含有花器官發(fā)育、器官分化以及細胞循環(huán)等基因。利用文庫測序獲得的contig序列本研究開發(fā)出

5、115個沙田柚SNP位點，選取Contig34中SNP位點設(shè)計引物在五個柑橘屬材料中片段擴增，序列比對，結(jié)果證實預(yù)測SNP位點的可靠性。進一步通過檢測花發(fā)育相關(guān)標志性基因表達，證明該文庫囊括所需各類組織特異性表達基因，滿足后續(xù)工作需要。
　　3)利用構(gòu)建文庫獲得的2228條柚Unigene序列，我們開發(fā)出161對柚EST-SSR引物，其中130對引物在柑橘屬植物中具有通用性。經(jīng)枳殼和紅橘及其96個子代群體檢測，61對柚EST-SS

6、R引物適合柑橘遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。在所開發(fā)出的通用引物中，通用率在柑橘屬不同種中并不相同，甜橙、橘、檸檬、金柑以及枳中通用率分別為76％、76％、75％，、74％和73％。利用我們開發(fā)的柚EST-SSR引物，在39份柑橘不同近緣種材料中擴增，親緣關(guān)系聚類結(jié)果表明，柚EST-SSR可以清楚的將柑橘不同種材料區(qū)分開來，證明柚EST-SSR引物適合柑橘類植物遺傳多樣性分析，親緣關(guān)系及品種鑒定;此外利用其中120對柚EST-SSR引物擴增篩選，最

7、終獲得一對可靠性極高的能夠證明秭歸沙田柚材料與廣西沙田柚在DNA分子水平存在穩(wěn)定差異的引物。
　　4)利用文庫獲得的2228條Unigene序列信息，我們篩選到與已知控制自交不親和基因S-RNase高度同源基因，命名為S-likeRNase基因，利用RACE技術(shù)獲得全長序列，其ORF區(qū)由834bp組成，編碼一個由278個氨基酸組成的蛋白，分子量大小為31.3KDa，等電點為5.42。柚S-likeRNase與已知控制自交不親和的S

8、-RNase基因具有高度的同源性，并且都包含有五個保守的結(jié)構(gòu)域，即C1、C2、C3、C4、C5結(jié)構(gòu)域，此外還包含有兩個組氨酸活性位點，七個保守半胱氨酸殘基，聚類分析表明我們獲得的柚S-likeRNase與金魚草的AhSL28最為接近。Southern雜交證實該基因在柚類中以單拷貝形式存在;表達分析表明該基因在柚花器官不同組織中都有表達，不同于控制自交不親和的S-RNase基因具有特異性在花柱中表達特性，該結(jié)果證明柚類材料中并不具有與S-

9、RNase介導(dǎo)自交不親和相似機制，也說明柚類植物中存在新的控制自交不親和遺傳機制。進一步時空表達分析，結(jié)果表明柚S-lileRNase特異性地在成熟子房中上調(diào)表達，暗示該基因可能參與子房成熟衰老過程。
　　5)利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，詳細比較了自交親和材料秭歸沙田柚與自交不親和材料廣西沙田柚成熟花粉，花柱蛋白表達譜，通過篩選將花柱，花藥差異蛋白切膠回收，共計200個蛋白點經(jīng)MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，最終共獲得188個有效蛋白

10、點，其中花柱差異蛋白點共計有116個;花粉差異蛋白點共計有72。將我們鑒定到的差異蛋白經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對后，結(jié)果表明其中并未發(fā)現(xiàn)與控制薔薇科等配子體自交不親和相關(guān)的S-RNase蛋白存在，該結(jié)果更進一步證明我們前面的結(jié)論即控制柚自交不親和遺傳機制不同與S-RNase介導(dǎo)的自交不親和機制。特別值得注意的是，我們鑒定到的多個與十字花科自交不親和相關(guān)基因即S位點受體激酶即SRK基因，本研究中獲得的大量S位點受體激酶類蛋白信息為我們進一步研究