捻轉(zhuǎn)血矛線蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆、表達與生物學(xué)特性研究.pdf

1、羊是我國重要的家畜品種，全國各地分布廣泛，飼養(yǎng)量居世界第一，由于管理粗放，寄生蟲發(fā)病率和患病數(shù)量巨大，據(jù)調(diào)查，我國山、綿羊嬴患捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的比例高達50％-93.85%，給養(yǎng)殖業(yè)主造成了巨大的損失，嚴重影響了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展．捻轉(zhuǎn)血矛線蟲屬毛圓科(Traehostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)線蟲，寄生于羊的真胃和小腸前段，引起貧血綜合癥，造成感染羊貧血，消瘦和衰弱，甚至死亡．
　　 絲氨酸蛋白酶抑制因子是天

2、然免疫系統(tǒng)的組成成分之一，屬于絲氨酸蛋白酶抑制因子超家族蛋白成員，該家族蛋白參與的反應(yīng)涉及血液凝固、抑制蛋白酶活性、炎性細胞趨化分泌、黑化、生殖、細胞凋亡．腫瘤轉(zhuǎn)移和信號傳導(dǎo)等重要的生理過程．絲氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制因子在寄生蟲感染和免疫應(yīng)答中具有重要作用，它們彼此協(xié)同直接導(dǎo)致病源入侵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和級聯(lián)放大，調(diào)節(jié)體內(nèi)的生化反應(yīng)和代謝強度，如血液凝固、蛋白水解和信號傳導(dǎo)等，因此，克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的絲氨酸蛋白酶抑制因子基因并研究其功能，

3、將有助于進一步研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的入侵機制和羊抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫防御機制，豐富和發(fā)展抗寄生蟲免疫學(xué)的內(nèi)容．
　　 本研究采用cDNA末端快速擴增技術(shù)，首次克隆了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子基因（hcserpin），并對此基因進行了測序分析和原核表達，利用親和色譜和排阻色譜技術(shù)，獲得了純化重組蛋白HCSERPIN，在此基礎(chǔ)上對HCSERPIN的生物學(xué)特性做了如下研究：
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲serpin基因的克隆與序列

4、分析
　　 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子屬于絲氨酸蛋白酶的抑制因子超家族蛋白，這類抑制因子引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)廣泛參與寄生蟲和宿主問的病理生理過程．為了克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲絲氨酸2白酶抑制因子基因，本文根據(jù)GenBank發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子基因的EST序列(GenBank登錄號為：BM173953，長度536bp)．設(shè)計并合成特異性引物，分別采用3’-和5’-cDNA末端快速擴增技術(shù)（RapidAmplifica

5、tion of cDNA Ends，RACE），獲得了該基因的3’-和5’-末端序列．通過序列拼接，得到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲serpin全基因序列，并將該serpin基因序列遞交GenBank確認（確認登錄號：FJ888352）．序列分析與比對表明，該基因全長為1317 bp，其5'-末端-2-22處有一21bp的SL1剪接導(dǎo)引序列．由SL1序列是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲操縱子結(jié)構(gòu)下游基因的標志分析，標志著下游serpin基因的存在，表明serpin在基因

6、組中以操縱子結(jié)構(gòu)形式存在，且屬于該操縱子下游基因．SL1后間隔一個稿基推測的最大開放閱讀框長為ll04 bp，編碼一條367個氨基酸組成的多肽鏈，該基因與已知serpin核酸序列同源性分別為66--100%．對該序列進一步分析發(fā)現(xiàn)，由serpin基因所推測蛋白的367個氨基酸殘基有4個N-糖基化位點，11個0-糖基化位點，3個蛋白激酶C磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位點，4個酪蛋白激酶II磷酸化位點，3個肉豆蔻酯?；稽c，推測其為糖

7、蛋白，其理論等電點和最大分子量(Theoretical pI/Mw)分別為8.5/41016.17道爾頓．Serpin標志序列FEANHPFLFIL位于推測蛋白的344-354氨基酸處，并無信號肽剪切位點．該蛋白與已知Serpins的氨基酸同源性為31--53%．C-端結(jié)構(gòu)域的同源性為29-62%不等．C-端的保守性Serpins超家族基序分別位于RSLI:GTTA319-322，RSL2: FEANHP344-349．根據(jù)以上的比較與

8、分析，本研究采用RACE克隆的全長cDNA是屬于serpin蛋白家族的新基因．
　　 2．HCSERPIN的原核表達與重組蛋白純化
　　 根據(jù)獲得的hcserpin基因全長cDNA序列設(shè)計一對特異性引物，采用RT-PCR方法，擴增該全長cDNA序列的最大閱讀框，連接于PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑陽性質(zhì)粒測序，選擇測序正確的質(zhì)粒切取目的基因片段，定向克隆于pET32a(+)質(zhì)粒載體，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET3

9、2a(+)-hcserpin．導(dǎo)入大腸桿菌BL21( DE3)表達，用IPTG誘導(dǎo)，獲得重組蛋白HCSERPIN，經(jīng)親和色譜和排阻層析分離與純化，獲得純化的rHCSERPIN蛋白；以此rHCSERPIN免疫大鼠，制備多克隆抗體，用Western blotting檢測rHCSERPIN免疫原性，以免疫血清檢測蟲體可溶性蛋白和自然感染Hcontortus山羊血液內(nèi)的HCSERPIN抗體．結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)酶切與PCR鑒定，亞克隆的ORF序列與預(yù)

10、期的完全一致，定向連接正確，IPTG誘導(dǎo)后，表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)過兩次色譜純化、復(fù)性的重組蛋白rHCSERPIN，分量大小約為60.5kD與預(yù)期相符，電泳檢測為單一條帶．ELISA檢測表明，rHCSERPIN蛋白具有良好的免疫原性，蟲體可溶性蛋白檢測可見一條HCSERPIN蛋白帶，表明蟲體內(nèi)的HCSERPIN無異構(gòu)體或聚合體分子存在．同時發(fā)現(xiàn)自然感染的山羊血清中存在抗rHCSERPIN蛋白的抗體，說明蟲體的HCSERPIN蛋白能

11、夠泌出Hcontortus細胞外進入山羊組織，引起山羊抗H.contortus的免疫應(yīng)答．通過蛋白質(zhì)rHCSERPIN的表達純化，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子的性質(zhì)、功能和在蟲體中的分布等各項研究，奠定了基礎(chǔ)．
　　 3.rHCSERPlN抗胰蛋白酶作用及最適反應(yīng)條件
　　 將復(fù)性的重組HCSERPIN蛋白用PBS緩沖液調(diào)整到一定的濃度，與一定量的牛trypsin均勻混合，置于37℃水浴孵育，再加入一定量溶于同樣緩

12、沖液的牛血清白蛋白作底物，繼續(xù)孵育一段時間，反應(yīng)結(jié)束通過12%SDS-PAGE變性凝膠電泳法，測定trypsin對底物水解能力的變化．另以BAEE為底物測定trypsin的酶活性抑制率，以及rHCSERPIN抑制活性的最適pH和最適溫度．實驗結(jié)果表明，rHCSERPIN能顯著抑制反應(yīng)管中trypsin活性，抑制率最高達52.3%，抑制后可見SDS-PAGE膠中牛血清白蛋白水解不完全，對照管中的BSA水解完全．rHCSERPIN產(chǎn)生抑制作

13、用的最適pH為7.6，最適反應(yīng)溫度介于37℃--75℃之間．說明本實驗表達純化的rHCSERPIN對trypsin有抑制作用，屬于耐熱型酶，最適抑制pH為7.6．這些結(jié)果將為進一步闡明H.contortus生化特性、致病機理及免疫機理提供科學(xué)依據(jù)．
　　 4．rHCSERPIN的體外抗凝血試驗
　　 通過采用試管法測定純化rHCSERPIN的體外凝血時間，將rHCSERPIN調(diào)整為5ug/ul，0.5 ug/ul和0.0

14、5 ug/ul，測定體外抗凝血酶時間和血漿復(fù)鈣時間，研究大腸桿菌表達純化后的重組HCSERPIN對凝血系統(tǒng)的作用，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel2008統(tǒng)計軟件進行分析．結(jié)果表明，rHCSERPIN能顯著延長兔全血的凝固時間，濃度50 ug/lOOul的rHCSERPIN能將兔全血的凝血時間延長一倍．在給定的劑量實驗中，rHCSERPIN能延長抗凝血酶時間和復(fù)鈣時間(p<0.01)，隨著蛋白濃度的增加，這種凝固時間也相應(yīng)延長，呈現(xiàn)出明顯的劑量依

15、賴關(guān)系．這些結(jié)果說明，rHCSERPIN對內(nèi)源性激活的凝血途徑以及外源性凝血過程，均有抑制作用．
　　 5．HCSERPIN在H.contortus體內(nèi)的分布
　　 新鮮采集的Hcontortus成蟲經(jīng)波恩氏液固定，石蠟包埋切片，采用免疫組化的方法研究HCSERPIN蛋白在雌、雄Hcontortus成蟲體內(nèi)的分布與表達．結(jié)果表明，特異性免疫反應(yīng)僅出現(xiàn)在H.contortus消化道黏膜上皮細胞，進一步觀察發(fā)現(xiàn)，這種特異性免