基于定向核酸酶技術(shù)的馬鈴薯基因組編輯體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum)是四大糧食作物之一,同時又是植物分子遺傳學(xué)研究的重要模式植物之一。馬鈴薯淀粉在造紙業(yè)、食品加工、膠黏劑生產(chǎn)以及飼料加工等工業(yè)上應(yīng)用獨具優(yōu)勢,是一種重要的工業(yè)淀粉原材料。淀粉因為其結(jié)構(gòu)差異分為直鏈淀粉(amylase)和支鏈淀粉(amylopectin)2種,兩者的含量比例是淀粉粒結(jié)構(gòu)和特性的決定因素,影響著淀粉的質(zhì)量、功能和應(yīng)用領(lǐng)域。馬鈴薯淀粉體中的淀粉合成代謝途徑涉及多種酶的參與,其中GBS

2、S(granule bound starch synthase),SS(starch synthase)和SBE(starch branching enzyme)是馬鈴薯淀粉合成的關(guān)鍵酶。關(guān)鍵酶的活性對馬鈴薯直鏈淀粉與支鏈淀粉比例、淀粉鏈長及結(jié)構(gòu)有極大的影響。至今針對馬鈴薯GBSS、SS和SBE基因進行的性狀改良已經(jīng)取得了一定的進展,通過翻譯表達技術(shù)和RNAi技術(shù)已經(jīng)成功獲得低直鏈淀粉、高支鏈淀粉的馬鈴薯新材料。但由于RNAi技術(shù)本身的

3、局限性,目標基因突變體材料普遍存在穩(wěn)定性差、目標基因轉(zhuǎn)錄活性難以實現(xiàn)完全“敲除”(knock out)、RNAi表達單元需永久整合等問題,實際研究及應(yīng)用中迫切需要一種能特異性針對目標基因徹底實現(xiàn)去功能化,并能獲得穩(wěn)定的馬鈴薯種質(zhì)新材料的新方法,以更好滿足馬鈴薯基礎(chǔ)及應(yīng)用研究的需要。
　　近年來,以ZFN(zinc finger nuclease)和TALEN( transcription activator-like effect

4、or nuclease)為代表的基因定向遺傳修飾新技術(shù)成為基因組工程研究及應(yīng)用領(lǐng)域最具潛力的新工具。本研究以TALEN技術(shù)體系在馬鈴薯中的建立為出發(fā)點,針對馬鈴薯基因組結(jié)構(gòu)特性和TALEN組裝原理,建立了高效率,高活性,高特異性,高穩(wěn)定性的的馬鈴薯TALEN技術(shù)體系,優(yōu)化了馬鈴薯復(fù)雜基因組TALEN設(shè)計,構(gòu)建,表達,檢測和篩選的最佳方案。在此基礎(chǔ)上,針對馬鈴薯淀粉合成的關(guān)鍵酶,特別是直鏈淀粉合成酶,如GBSS,構(gòu)建了特異性TALEN表達