甜橙果實(shí)發(fā)育與成熟過程中轉(zhuǎn)錄組變化及CsASR基因的功能分析.pdf

1、果實(shí)發(fā)育是一個高度協(xié)調(diào)的復(fù)雜生物學(xué)過程。作為非呼吸躍變型果實(shí)，柑橘果實(shí)發(fā)育和成熟過程的研究盡管已經(jīng)逐步得到重視，但是對其分子調(diào)控機(jī)制的詮釋還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。果實(shí)成熟過程中形成的糖、酸和類胡蘿卜素等物質(zhì)是柑橘果實(shí)品質(zhì)的重要組成部分，因此，研究柑橘果實(shí)成熟的分子以及類胡蘿卜素等的積累機(jī)制對提高果實(shí)品質(zhì)具有重要的理論價值。突變體‘紅暗柳’甜橙果實(shí)在具有紅肉性狀的同時也表現(xiàn)為高蔗糖和低檸檬酸水平，為我們研究果實(shí)品質(zhì)性狀形成的分子機(jī)理提供了理想材料。本

2、研究以突變體‘紅暗柳’與野生型‘暗柳’為材料，采用表達(dá)譜測序技術(shù)分析了兩者果實(shí)發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組的差異，并重點(diǎn)描述了甜橙果實(shí)發(fā)育和成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化，同時對一個候選基因CsASR的功能進(jìn)行分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1利用Illumina測序平臺對‘紅暗柳’與‘暗柳’各4個發(fā)育時期（120 DAF,150 DAF,190 DAF和220 DAF）果實(shí)的果肉進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測序。獲得的平均標(biāo)簽數(shù)目約4.01M。將測序所得

3、所有標(biāo)簽與參考數(shù)據(jù)庫中的序列比對，發(fā)現(xiàn)占clean reads68.1％-76.2％共46，328-76，424條標(biāo)簽與參考數(shù)據(jù)庫中已知功能或未知功能的序列具有同源性。
　　 以‘暗柳’為模型研究甜橙果實(shí)發(fā)育與成熟過程中的轉(zhuǎn)錄組變化?？偣矙z測到18，829個基因至少在一個時期表達(dá)，其中8，825個基因在所有四個時期都有表達(dá)。利用Cluster軟件對‘暗柳’甜橙果實(shí)發(fā)育和成熟過程中基因的表達(dá)模式進(jìn)行聚類分析，所有的18，829個基

4、因被聚成22類。聚類分析的結(jié)果也顯示在‘暗柳’甜橙里檢測到89.7％的基因表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育和成熟的過程中發(fā)生了變化。比較突變體與野生型的基因表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)兩個品種中有20類表達(dá)模式是共同的。
　　 比較‘暗柳’甜橙不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組分別發(fā)現(xiàn)9，377個基因在花后120 d和150 d差異表達(dá);7，886個基因在花后150 d和190 d差異表達(dá);7，757個基因在花后190 d和220 d差異表達(dá)。生物學(xué)過程的GO注釋分類結(jié)果顯示

5、，這些基因中36.7％被注釋18條GO類型，且絕大部分基因被注釋到代謝過程、細(xì)胞過程、建立定位、生物學(xué)調(diào)節(jié)、著色和逆境響應(yīng)等。這些差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞壁代謝和軟化、蔗糖代謝、三羧酸循環(huán)、類胡蘿卜素代謝和逆境響應(yīng)。
　　 比較不同發(fā)育時期‘暗柳’‘紅暗柳’果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果顯示分別有634、568、540和616個基因的表達(dá)在突變體和野生型花后120 d、150d、190 d和220 d有顯著差異(p＜0.05和|log2Ra

6、tio[≥1)。許多差異表達(dá)基因編碼逆境相關(guān)蛋白。對差異表達(dá)基因的數(shù)目進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在所有研究的這四個時期，突變體上調(diào)表達(dá)基因數(shù)目都少于該時期下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目。去除冗余，在‘暗柳’和‘紅暗柳’中差異表達(dá)的基因數(shù)目僅883個。對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)除花后150 d外，與野生型相比超過一半的基因(492)在突變體所有的發(fā)育時期均上調(diào)表達(dá)。僅5個基因被發(fā)現(xiàn)在所有四個時期均差異表達(dá)?；诜肿庸δ艿腉O注釋分類分析顯示883個差異表達(dá)

7、基因大多數(shù)被注釋到蛋白結(jié)合、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性和轉(zhuǎn)運(yùn)子活性。GO富集分析顯示類胡蘿卜素代謝過程和辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶活性在突變體花后150 d的果實(shí)顯著富集。
　　 利用Real-Time PCR的方法對選擇的22個差異表達(dá)基因在突變體和野生型果實(shí)發(fā)育和成熟過程中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，獲得的基因表達(dá)模式與高通量測序所得的結(jié)果基本一致，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.8379。
　　 我們也測定了‘暗柳’和‘紅暗柳’果實(shí)發(fā)育和成熟

8、過程中果肉可溶性糖、有機(jī)酸、類胡蘿卜素和H2O2的含量變化。在果實(shí)發(fā)育和成熟的后期可溶性糖的含量在‘暗柳’和‘紅暗柳’中均顯著增加。在整個果實(shí)發(fā)育和成熟過程中，‘紅暗柳’果肉中的蔗糖含量均顯著高于‘暗柳’，但是檸檬酸含量均顯著低于‘暗柳’。總類胡蘿卜素和番茄紅素在‘紅暗柳’中大量積累，但是在‘暗柳’中均維持比較低的含量。隨著果實(shí)的發(fā)育和成熟，H2O2的含量下降，但是在花后120 d，‘紅暗柳’果肉中H2O2含量顯著高于‘暗柳’。

9、　　 2轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果以及前人的報道都顯示ASR基因在‘紅暗柳’和‘暗柳’中表達(dá)差異顯著。根據(jù)獲得的基因片段(FE659120)利用Tail-PCR擴(kuò)增獲得甜橙ASR基因的cDNA全長，命名為CsASR，GenBank登錄號為HQ398364。進(jìn)一步在甜橙中擴(kuò)增獲得DNA全長1213 bp，含一個內(nèi)含子。CsASR的cDNA全長為929 bp，開放讀碼框?yàn)?40 bp，編碼179個氨基酸。同源性分析表明甜橙CsASR推導(dǎo)的氨基酸序列

10、與其他物種克隆的ASR基因有較高的同源性。保守區(qū)域分析表明CsASR與其他已知的ASR蛋白一樣，它們的氨基酸序列都包含兩個高度保守的區(qū)域。功能預(yù)測推測其可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，生長發(fā)育，轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，概率分別為0.241，0.110，0.072和0.063。
　　 Southern雜交分析顯示在大多數(shù)柑橘品種中，CsASR屬于一個小的多基因家族。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)CsASR與其他大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子一樣定位在細(xì)胞核中。對CsASR基因在‘

11、暗柳’和‘紅暗柳’不同發(fā)育時期果實(shí)以及不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsASR基因主要在成熟組織，特別在成熟果實(shí)中表達(dá)。CsASR基因在‘暗柳’的果肉和果皮中的表達(dá)模式相同，但是在‘紅暗柳’的果肉和果皮中CsASR的表達(dá)模式不同，除了在花后120 d，整個發(fā)育時期CsASR基因在‘紅暗柳’中的表達(dá)都比在‘暗柳’中的高。對CsASR基因在不同逆境條件下甜橙愈傷中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示高鹽、低溫、熱和ABA處理?xiàng)l件下，CsASR基因均

12、被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 用外源ABA處理‘暗柳’和‘紅暗柳’轉(zhuǎn)色前果實(shí)，結(jié)果顯示ABA誘導(dǎo)‘紅暗柳’果肉中可溶性糖和有機(jī)酸含量增加，而在‘暗柳’中，ABA處理導(dǎo)致可溶性糖和有機(jī)酸含量降低。但是對于類胡蘿卜素我們只檢測到花藥黃質(zhì)和α-胡蘿卜素，盡管ABA處理后‘暗柳’果肉中類胡蘿卜素的含量降低，但是在‘紅暗柳’果肉中ABA處理前后類胡蘿卜素的含量沒有顯著的變化。
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化在番茄中超量表達(dá)CsASR基因，

13、共獲得11株抗性植株，T1代分離的陽性植株成熟果實(shí)顯示與對照不同的紅色。這些抗性植株與對照相比在形態(tài)學(xué)及果實(shí)的成熟期上并沒有明顯的差異。微分干涉顯微觀察的結(jié)果顯示超量表達(dá)CsASR的番茄成熟果實(shí)的果皮細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，而對照為黃色。冷凍切片在明場下也顯示兩者的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所不同，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的細(xì)胞壁與對照相比增厚;進(jìn)一步在熒光下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的細(xì)胞壁呈現(xiàn)很強(qiáng)的藍(lán)色熒光，即木質(zhì)素含量較高，而對照表現(xiàn)不明顯。
　　 HPLC分析

14、結(jié)果顯示紫黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、番茄紅素和八氫番茄紅素的含量在CsASR超量表達(dá)番茄植株的成熟果實(shí)中都顯著增加，而葉黃素的含量沒有明顯的差異。與對照相比，所有檢測的類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因在CsASR超量表達(dá)番茄植株的成熟果實(shí)中都上調(diào)表達(dá)。
　　 GC-MS分析結(jié)果顯示很多主要代謝產(chǎn)物的含量在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中均發(fā)生了改變。幾乎所有檢測到的糖類代謝物及包括三羧酸循環(huán)代謝中間產(chǎn)物在內(nèi)的所有檢測到的有機(jī)酸的含量在CsASR超量表達(dá)的番茄果

15、實(shí)中都低于對照。很多氨基酸的含量也發(fā)生了變化。對CsASR超量表達(dá)的番茄果實(shí)中主要代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要代謝產(chǎn)物的變化與相應(yīng)基因表達(dá)是吻合的。LC-MS技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中ABA的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsASR超量表達(dá)的番茄果實(shí)中ABA的含量顯著低于對照。
　　 表達(dá)譜測序結(jié)果顯示，與對照相比總共有401個基因在CsASR超量表達(dá)番茄果實(shí)中顯著差異表達(dá)(FDR≤0.001 and|log2Ratio|≥1)，其中18