油茶PAL基因的全長(zhǎng)克隆及其在原核和真核生物中的表達(dá).pdf

1、油茶(Camellia oleifera)是我國(guó)重要的木本食用油料樹種,與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料樹種。茶油中油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的含量在90％以上,是一種優(yōu)質(zhì)食用油。但是由于病蟲害時(shí)常發(fā)生,嚴(yán)重影響油茶林的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的發(fā)揮。目前,研究較多的與植物抗病性相關(guān)的酶是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL),它是苯丙烷類代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶、限速酶。苯丙烷類代謝化合物對(duì)

2、植物生長(zhǎng)、抗病、抗逆及構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)方面具有重要作用。因此,對(duì)油茶PAL的基因操作具有重要的實(shí)際意義。本論文主要在油茶PAL的克隆、鑒定以及表達(dá)載體構(gòu)建方面開展了一些研究工作,主要研究結(jié)果如下:
　　 1、油茶PAL基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析。從本實(shí)驗(yàn)室油茶cDNA文庫(kù)中鑒定出一條PAL基因的全長(zhǎng)cDNA,長(zhǎng)度為2118bp,經(jīng)與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,確定為PAL基因,該基因編碼705個(gè)氨基酸。應(yīng)用一系列生物信息

3、學(xué)分析方法對(duì)其等電點(diǎn)、分子量、跨膜結(jié)構(gòu)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示:PAL蛋白質(zhì)的分子量為77.077KDa,等電點(diǎn)為6.115。PAL整個(gè)蛋白的疏水指數(shù)從-2.656到3.244,其中除在110位、340位以及480位氨基酸表現(xiàn)出親水性,整條多肽鏈表現(xiàn)出疏水性。PAL蛋白有兩個(gè)比較明顯的跨膜區(qū)。PAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋結(jié)構(gòu)為52.55％,β折疊為6.23％,無(wú)規(guī)則卷曲及其他結(jié)構(gòu)達(dá)到了41.22％?？v觀PAL蛋白質(zhì)的整體結(jié)

4、構(gòu),α螺旋是油茶PAL的主要結(jié)構(gòu)元件,而不規(guī)則卷曲則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。
　　 2、油茶PAL基因的全長(zhǎng)基因組序列克隆。根據(jù)油茶PAL全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物,以油茶總DNA為模板,通過(guò)PCR反應(yīng),克隆油茶PAL基因組序列,結(jié)果分析顯示:該基因有一個(gè)內(nèi)含子,長(zhǎng)度為768bp,位于起始密碼子下游372bp處,而且內(nèi)含子兩端具有保守序列GT/AG。
　　 3、油茶PAL基因的原核表達(dá)。將編碼油茶PAL的片段定向克隆到pET-

5、28a載體上,構(gòu)建的原核表達(dá)載體命名為pET-PAL。采用24℃低溫誘導(dǎo)重組菌20h,提取細(xì)菌粗酶液,檢測(cè)酶學(xué)活性表明:重組蛋白的最適溫度為70℃,最適pH為8.7。在最適條件下,測(cè)得PAL的酶活力為2.583×10-2U,從而計(jì)算出苯丙氨酸解氨酶PAL的比活力為36,38μ mol/min·g pro。與其他文獻(xiàn)報(bào)道中相比,油茶重組PAL比活力低于大豆、歐芹重組蛋白活性,高于紅酵母重組PAL蛋白的活性,但總體看來(lái),油茶重組PAL活性不