甜菜M14品系BvM14-SAMS2基因的克隆及鹽、氧化脅迫下的應(yīng)答.pdf

1、甜菜M14品系富含豐富的優(yōu)質(zhì)基因資源，對(duì)鹽、寒冷、干旱等非生物脅迫具有極強(qiáng)的耐受性，是研究逆境脅迫極為難得的材料。課題組前期以甜菜M14品系為試驗(yàn)材料，在500mM NaCl脅迫下，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從蛋白質(zhì)水平篩選獲得了75個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn);利用SSH技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平篩選獲得了58個(gè)Unigenes序列，二者匹配得到了蛋白質(zhì)點(diǎn)——BvM14-SAMS2。
　　本試驗(yàn)以上述蛋白質(zhì)點(diǎn)為基礎(chǔ)，采用RACE技術(shù)，克隆獲得甜菜M14品系B

2、vM14-SA MS2基因cDNA全長(zhǎng)1538bp，包含最大開(kāi)放閱讀框ORF1182bp，編碼393個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。同源序列分析發(fā)現(xiàn)，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtSAMS氨基酸序列相似性達(dá)到了98％。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量(Real-Time PCR)技術(shù)對(duì)甜菜M14品系BvM14-SA MS2基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下，BvM14-SAMS2基因

3、在甜菜M14品系根、莖、葉、花中的表達(dá)量大小依次為:根＞葉＞花＞莖，其中，BvM14-SA MS基因在根中的表達(dá)量比葉片中高出4.26倍。對(duì)甜菜M14品系進(jìn)行不同鹽濃度的脅迫處理后，分別以0mM NaCl脅迫下的根和葉片為對(duì)照，對(duì)脅迫后甜菜M14品系葉片和根中的BvM14-SAMS2基因進(jìn)行表達(dá)量的比較分析，發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加，BvM14-SAMS2基因在葉片中的表達(dá)量逐漸增加，在鹽濃度達(dá)到500mM時(shí)，表達(dá)量增加了49％。而根中，

4、隨著鹽濃度的增加，BvM14-SAMS2基因的表達(dá)量無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，受鹽脅迫誘導(dǎo)，BvM14-SAMS2基因在甜菜M14品系葉片中的表達(dá)量隨著鹽濃度的增大而增大，根中的表達(dá)量隨著鹽濃度的增大無(wú)明顯變化。
　　本試驗(yàn)對(duì)甜菜M14品系BvM14-SAMS2基因進(jìn)行了原核表達(dá)體系的研究，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-BvM14-SAMS2，并將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)Western印跡鑒

5、定，結(jié)果表明，BvM14-SAM S2蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，測(cè)定BvM14-SAMS2蛋白濃度為73.57μg/ml，BvM14-SAMS2蛋白酶活力為1.24U/mg。
　　本試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)BvM14-SAMS2基因擬南芥在脅迫下的應(yīng)答進(jìn)行了研究，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMS2，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。利用花序侵染法分別獲得了擬南芥SAMS基因過(guò)表達(dá)植株(OX)和擬南芥SA

6、MS基因敲除恢復(fù)型植株(CO)的T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。以擬南芥野生型植株(WT)和SAMS基因敲除植株(KO)為對(duì)照，分別測(cè)定SAMS基因過(guò)量表達(dá)植株(OX)和SAMS基因敲除恢復(fù)植株(CO)的T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株在鹽、氧化脅迫下的鮮重、根長(zhǎng)、葉綠素、脯氨酸、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)酶活，以及SAMS酶活等指標(biāo)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入BvM14-SAMS2基因的SAMS基因過(guò)