果梅自交不親和基因的克隆及自交親和品種的鑒定.pdf

1、果梅(Prunus mume Sieb.et Zucc)原產(chǎn)于中國，屬于薔薇科典型的配子體自交不親和(Gametophytic self-incompatibility，GSI)樹種，但在長期進(jìn)化過程中也出現(xiàn)了自交親和品種(Self-compatibility，SC)。GSI至少由S位點(diǎn)的花柱S(S-RNase)基因和花粉S(SFB/SLF)基因決定。為了進(jìn)一步豐富果梅的自交不親和基因信息和研究清楚自交親和突變機(jī)制，本研究以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

2、國家果梅種質(zhì)資源圃的果梅為材料，克隆了新的自交不親和基因，并對自交親和品種進(jìn)行了鑒定分析。這些將對果梅品種田間授粉樹的合理配置和雜交育種的親本選擇提供合理的依據(jù)，并為深入探討果梅自交不親和作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.應(yīng)用AS-PCR技術(shù)對18個(gè)果梅品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。所用引物Pru-C2和PCE-R，是根據(jù)李屬S-RNase基因序列的第二和第三個(gè)保守區(qū)分別進(jìn)行設(shè)計(jì)的。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5％瓊脂糖凝膠

3、電泳檢測后，8個(gè)果梅品種擴(kuò)增到兩條目的條帶，5個(gè)品種擴(kuò)增到一條目的條帶。其中只有一條目的條帶的和沒有擴(kuò)增出目的條帶的品種，再用具有更好分辨率的6.0％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。最后，14個(gè)品種的DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增都能得到兩條目的條帶，剩余4個(gè)品種每個(gè)只能檢測到一條目的條帶。經(jīng)過克隆和測序分析，獲得13個(gè)已知的S-RNase基因(S1、S2、S7、S9、S12、S14、S15、S18、S20、S22、S24、S23和S26)和7個(gè)新S-R

4、Nase基因(S30、S31、S32、S33、S34、S35和S36),新基因GenBank登錄號依次為JN232975、JN232976、JN232977、JN232978、JX065222、JX065223和JX065224。
　　2.利用根據(jù)李屬SFB基因保守序列設(shè)計(jì)的引物SFB-C1F和Pm-Vb對12個(gè)品種的基因組DNA進(jìn)行SFB基因的擴(kuò)增。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，每個(gè)品種只得到一條1000bp左右的條帶?？寺『蜏y序結(jié)

5、果表明:每個(gè)品種都有兩個(gè)不同的SFB基因，12個(gè)新SFB基因得到鑒定，新基因和GenBank登錄號如下:PmSFB2(JQ356589)、PmSFB12(JQ356586)、PmSFB14(JQ356596)、PmSFB18(JX065217)、PmSFB22(JQ356584)、PmSFB24(JQ356595)、PmSFB31(JQ356588)、PmSFB34(JQ356597)、PmSFB40(JQ356585)、PmSFB41

6、(JQ356593)、PmSFB42(JQ356581)和PmSFB43(JQ356578)。
　　另外，對本文鑒定的果梅S-RNase基因和SFB基因進(jìn)行了序列分析，并通過RT-PCR-了其表達(dá)情況，結(jié)果表明:它們都具有典型的基因結(jié)構(gòu)，分別在花柱和花粉中特異表達(dá)。
　　3.通過田間自交授粉試驗(yàn)確定了原產(chǎn)于中國的‘四川白梅’和‘長農(nóng)17’兩個(gè)果梅品種屬于自交親和品種。進(jìn)一步通過AS-PCR分析發(fā)現(xiàn)花粉SFB基因存在一段插入序

7、列，造成了分子水平的基因突變。推測該基因的突變使‘四川白梅’和‘長農(nóng)17’花粉SFB功能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致自交親和。
　　4.本研究通過重復(fù)的田間自交授粉實(shí)驗(yàn)確定了果梅品種‘早紅’屬于自交親和品種。而雜交授粉實(shí)驗(yàn)表明:果梅品種‘早紅’的自交親和變異是花粉S基因功能的突變導(dǎo)致的?！缂t’S基因的序列分析和RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn):S基因氨基酸序列具有李屬S基因典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，沒有任何基因突變;‘早紅’和具有相同S基因型的自交不親和品