PPO基因表達(dá)分析及雙孢蘑菇高效表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)是引起雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)褐變的關(guān)鍵酶，研究雙孢蘑菇不同生長時(shí)期以及不同處理?xiàng)l件下PPO基因的表達(dá)情況是進(jìn)一步研究PPO基因活性的基礎(chǔ)。構(gòu)建合適的雙孢蘑菇遺傳轉(zhuǎn)化體系、提高轉(zhuǎn)化率，為從分子水平上研究PPO基因以及雙孢蘑菇其他功能基因提供有利工具，對雙孢蘑菇遺傳育種有著重要意義。本文研究了雙孢蘑菇不同發(fā)育時(shí)期、不同處理下PPO基因表達(dá)的活性，建立了雙孢蘑菇的高

2、效轉(zhuǎn)基因體系，并構(gòu)建了雙孢蘑菇PPO基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
　　 以雙孢蘑菇不同發(fā)育時(shí)期的子實(shí)體以及采后的雙孢蘑菇在4℃貯藏條件下取樣，提取雙孢蘑菇的總RNA，并以18SrRNA為參照，利用半定量RT-PCR技術(shù)，對不同采樣的雙孢蘑菇中PPO基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析。雙孢蘑菇中已克隆出的四種PPO基因即AbPPO1、AbPPO2、AbPPO3、AbPPO4，在雙孢蘑菇發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中表達(dá)情況分別為AbPPO1在雙孢蘑菇各發(fā)

3、育階段表達(dá)情況基本一致，AbPPO2在發(fā)育中期較高，AbPPO3在成熟期較高，AbPPO4表達(dá)量逐漸增強(qiáng)。在4℃貯藏條件下，AbPPO1和AbPPO2表達(dá)量無明顯變化，AbPPO3和AbPPO4隨著貯藏時(shí)間的延長，先增加后減弱。
　　 克隆雙孢蘑菇gpd強(qiáng)啟動(dòng)子，并利用gpd強(qiáng)啟動(dòng)子，置換植物雙元表達(dá)載體pCambia1301中自帶的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，構(gòu)建適用于雙孢蘑菇轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pCghg，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌

4、中。通過研究不同轉(zhuǎn)化條件下的轉(zhuǎn)化效率，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙孢蘑菇的高效轉(zhuǎn)基因體系。結(jié)果表明，在農(nóng)桿菌侵染菌液濃度OD600nm為0.05、侵染時(shí)間30min、預(yù)培養(yǎng)時(shí)乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)濃度為200μmol、共培養(yǎng)24h的條件下，轉(zhuǎn)化效率最高，可達(dá)70％以上。
　　 根據(jù)雙孢蘑菇PPO3序列，設(shè)計(jì)特異引物，克隆雙孢蘑菇PPO3啟動(dòng)子，并置換表達(dá)載體pCambia1301中CaMV35S啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體