家蠶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2基因的克隆及功能性研究.pdf

1、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs，EC2.5.1.18）是一種多功能超家族酶類，普遍存在于真核和原核生物體內(nèi)。GSTs的主要功能是催化谷胱甘肽（GSH）與生物異源性物質(zhì)進行軛合反應(yīng)，此外，GSTs還參與生物機體內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，其具有的硒非依賴性谷胱甘肽過氧化物酶（non-SeGPx）活性，能夠保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷。除了具有催化功能之外，GSTs還能夠與一些疏水性物質(zhì)，如藥物、激素及一些代謝產(chǎn)物進行直接的螯合作用。根據(jù)氨基酸序列的相似性

2、和免疫關(guān)系等，將昆蟲的胞質(zhì)型GSTs分為6個已知家族，其中Sigma、Theta、Zeta和Omega四個家族普遍存在于大多數(shù)生物體中，而Delta和Epsilon為昆蟲所特異的家族，還有一些未被分類的昆蟲GSTs被發(fā)現(xiàn)。
　　家蠶（Bombyx mori）由野蠶（Bombyx mandarina）馴化而來，作為一種重要的經(jīng)濟昆蟲，蠶絲已被開發(fā)用于多個領(lǐng)域。同時，作為鱗翅目昆蟲的重要模式生物，家蠶被廣泛用于昆蟲的遺傳學和分子生物學

3、研究。近年來，家蠶全基因組測序的完成以及大量功能基因組學數(shù)據(jù)的公布，家蠶GSTs的全基因組分析鑒定已經(jīng)完成。本文主要對家蠶 GSTs Epsilon家族中的一個能被殺蟲劑誘導的基因BmGSTe2進行了克隆并展開功能研究，所得主要結(jié)果如下：
　　1.家蠶BmGSTe2基因的克隆和序列分析
　　通過RT-PCR從家蠶的中腸組織中克隆得到BmGSTE2編碼基因的全長cDNA，該基因在GenBank中的檢索號為：DQ355376。B

4、mGSTe2基因的開放讀碼框（ORF）全長為648 bp，編碼215個氨基酸殘基，編碼蛋白的分子量為24.72kDa，等電點為5.98。根據(jù)氨基酸序列相似性，挑選具有代表性的昆蟲GSTs，與BmGSTE2蛋白構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示，BmGSTE2與其他昆蟲的Epsilon家族成員聚為一類，表明 BmGSTE2確屬于昆蟲特異的 Epsilon家族。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測，檢測到BmGSTE2蛋白的三個保守結(jié)構(gòu)域：二聚體界面多肽結(jié)合位點，C-末端

5、底物結(jié)合位點（H-位點）和N-末端谷胱甘肽結(jié)合位點（G-位點）。
　　2.家蠶BmGSTE2蛋白的異源表達和酶活性測定
　　我們構(gòu)建了pET28a-BmGSTe2原核表達載體，并在大腸桿菌中進行誘導表達。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，BmGSTE2蛋白以可溶形式表達。通過離子交換色譜和超濾等方法對重組蛋白進行純化。純化后的 BmGSTE2重組蛋白對 GSTs模式底物CDNB的活性為5.24μmol/min/mg，對枯稀過氧化氫

6、表現(xiàn)出的non-SeGPx活性為0.10μmol/min/mg。在BmGSTE2的熱穩(wěn)定性檢測實驗中，通過對梯度溫度孵育后的蛋白進行活性測定，發(fā)現(xiàn)BmGSTE2的酶活性在50°C及以下保持相對穩(wěn)定。
　　選用兩種有機磷殺蟲劑（辛硫磷，毒死蜱）和一種擬除蟲菊酯類殺蟲劑（甲氰菊酯）對BmGSTE2重組蛋白的酶活性進行抑制性分析，三種抑制劑對BmGSTE2活性的抑制模式相似，酶活性都是隨著抑制劑濃度的升高而降低。辛硫磷和毒死蜱兩種有機磷

7、類殺蟲劑對BmGSTE2的酶活性抑制中濃度（IC50）分別為0.15 mM和0.18 mM，相比之下，甲氰菊酯對BmGSTE2的抑制強度更高，IC50為0.09 mM。
　　3.家蠶BmGSTE2蛋白的組織分布
　　利用免疫印跡技術(shù)檢測了BmGSTE2在蛋白水平的組織分布，通過對家蠶四個重要組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)BmGSTE2只在家蠶19-440品系5齡3天幼蟲的中腸組織中有表達。在實驗室條件下，分別用辛硫磷（有機磷類）和甲氰菊

8、酯（擬除蟲菊酯類）兩種殺蟲劑對家蠶（19-440品系）進行連續(xù)多代篩選，并用Western blotting檢測BmGSTE2在篩選前后家蠶品系中腸組織中的表達情況。結(jié)果表明，BmGSTE2在辛硫磷和甲氰菊酯篩選后的家蠶中腸組織的表達明顯高于未經(jīng)篩選的對照。因此，經(jīng)殺蟲劑的篩選，家蠶BmGSTE2出現(xiàn)了過表達。
　　4.家蠶BmGSTE2蛋白的組織定位
　　實驗通過免疫組織化學反應(yīng)對BmGSTE2蛋白進行組織定位。由于該蛋白

9、只在中腸組織有表達，所以僅選取中腸組織對目的蛋白做免疫組織化學定位分析。結(jié)果表明，BmGSTE2在家蠶中腸上皮的圓柱形細胞，杯形細胞和再生細胞中均有的表達信號。
　　綜上所述，利用辛硫磷和甲氰菊酯連續(xù)多代篩選的家蠶為材料，我們克隆了能被殺蟲劑誘導的BmGSTe2基因，該基因為中腸特異表達的基因。外源表達、殺蟲劑對酶活性抑制分析、免疫印跡等實驗證實BmGSTE2參與了家蠶幼蟲耐藥性的形成。對家蠶GSTs的功能性研究，不僅能為培育具有