犬H5N2流感病毒的分離鑒定及其分子生物學(xué)特征研究.pdf

1、本研究從56份臨床癥狀表現(xiàn)為體溫身高，咳嗽，流鼻涕的犬中分離到流感病毒，經(jīng)血凝和血凝抑制試驗(yàn)以及BLAST analysis最終確定為H5N2亞型。根據(jù)Genbank中流感病毒H5N2亞型各個(gè)基因序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增各基因片段的特異性引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增犬流感病毒(CIV)泰安分離株CA/SD/JT01/09各段基因，并分別將RT-PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體，進(jìn)行測序分析。為了研究H5N2流感病毒在犬中的流行情況，隨后采集

2、并制備了了大量的犬血清進(jìn)行抗體分析，從小部分的犬血清中成功分離得到了H5N2抗體。這表明了H5N2流感病毒能夠在犬中傳播。
　　 CA/SD/JT01/09 HA基因長度為1467bp，編碼466個(gè)氨基酸，HA蛋白切割位點(diǎn)序列為PQ↓REIRRK，屬于非高致病性毒株；分離段HA 含有4個(gè)氨基酸糖基化位點(diǎn)，分別為181-NNTD-,209-NPTT-,302-NSSM-，500-NGTY-，其中3個(gè)在HA1蛋白上，1個(gè)在HA2蛋白

3、上，與個(gè)別參考毒株糖基化位點(diǎn)個(gè)數(shù)不同。CA/SD/JT01/09 HA蛋白在45、184、444位發(fā)生了氨基酸突變，但沒有發(fā)生在HA重要的受體結(jié)合部位，其抗原性及其生物特性未發(fā)生變化；CA/SD/JT01/09 NA蛋白基因長為1172bp，編碼388個(gè)氨基酸，包含4個(gè)氨基酸糖基化位點(diǎn)，其中第50和338位發(fā)生了氨基酸突變，導(dǎo)致NA頸部50位由V突變?yōu)锳，可以推測對病毒的復(fù)制能力和宿主范圍會(huì)產(chǎn)生一定的影響。NP基因分離長度為1594bp

4、，編碼499個(gè)氨基酸，其中與MD/Ita/36/2002(H5N3)的NP基因同源性最高，達(dá)到97％，分離毒株在339、376、461位的氨基酸分別為R、N、A，參考毒株為C、D、D。犬流感病毒CA/SD/JT01/09其余基因序列PB2、PB1、PA、M、NS片段擴(kuò)增長度分別2174、2134、2062、1027、890，分別編碼724、711、687、252、226個(gè)氨基酸，各個(gè)片段基因序列與參考毒株最高同源性都大于90％。

5、　　 系統(tǒng)發(fā)生分析表明，流感病毒CA/SD/JT01/09氨基酸序列與參考序列最大同源性均大于93.3％；其中HA基因與SW/FJ/F1/01(H5N1)的同源性最高，屬于亞洲禽類譜系。NA蛋白與TK/WS/66(H9N2)同源性最高，親緣關(guān)系最近，經(jīng)分析表明NA基因?qū)儆谠缙诒泵狼蓊愖V系。NP蛋白與SW/FJ/F1/01(H5N1)同源性最高，親緣關(guān)系最近，屬于歐洲譜系。其余片段均與SW/FJ/F1/01(H5N1)同源性最高，親緣關(guān)