棉花GhADF7基因表達(dá)和功能初步分析.pdf

1、棉花（Gossypium hirsutum）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。分離鑒定棉花生殖發(fā)育相關(guān)的重要基因，解析棉花生殖發(fā)育的分子機(jī)制，對(duì)于棉花雜交育種，提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。 肌動(dòng)蛋白（actin）是真核生物細(xì)胞中普遍存在的一種重要蛋白。肌動(dòng)蛋白構(gòu)成細(xì)胞骨架中的微絲系統(tǒng)，參與有絲分裂、減數(shù)分裂、染色體運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)流動(dòng)等生命活動(dòng)。由于肌動(dòng)蛋白骨架參與了細(xì)胞內(nèi)一系列生理活動(dòng)，而肌動(dòng)蛋白解聚因子（ADF

2、）直接調(diào)控肌動(dòng)蛋白，因而必然對(duì)這些生理活動(dòng)有著重要的影響。目前大多數(shù)的研究都集中在動(dòng)物細(xì)胞，而對(duì)植物材料研究的報(bào)道相對(duì)較少。棉花中關(guān)于ADF基因的研究也集中在棉纖維發(fā)育的影響，而ADF在棉花生殖發(fā)育中的功能研究，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室從棉花cDNA文庫(kù)中分離克隆了7個(gè)ADF基因。通過基因表達(dá)模式的分析，我們從中篩選到一個(gè)在花藥中特異表達(dá)的ADF基因，命名為GhADF7。本文對(duì)該基因的表達(dá)及功能進(jìn)行了研究探討，取得如下主要結(jié)果： 1

3、.棉花GhADF7蛋白結(jié)構(gòu)具有高度保守性 序列分析表明，棉花GhADF7基因編碼一個(gè)含有139個(gè)氨基酸的ADF蛋白，包含一個(gè)PIP2/actin結(jié)合位點(diǎn)。該蛋白與其它7個(gè)棉花ADF蛋白的相似性為56-79％。其中，GhADF7與GhADF2相似性最高，達(dá)79％。GhADF7與其它植物花藥特異ADF蛋白相似性為66％-80％，如與NtADF2相同氨基酸相似性高達(dá)80％，較棉花ADF家族內(nèi)的ADF蛋白相似性還要高。系統(tǒng)進(jìn)化分析證實(shí)了

4、棉花ADF蛋白具有進(jìn)化的保守性。 2.棉花GhADF7基因在花藥中特異表達(dá) 利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步對(duì)GhADF7基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示GhADF7在棉花花藥中特異表達(dá)，且隨花藥發(fā)育過程表達(dá)量不斷升高。為進(jìn)一步研究GhADF7的組織特異和發(fā)育階段調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，利用Genome walking方法，分離獲得該基因的啟動(dòng)子，并構(gòu)建了GhADF7：：GUS融合載體。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，獲得一

5、批轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥植株。組織化學(xué)分析表明，在GhADF7啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，GUS基因在花藥中特異表達(dá)，進(jìn)一步石蠟切片分析發(fā)現(xiàn)GUS信號(hào)主要集中在花粉中。體外萌發(fā)轉(zhuǎn)基因煙草花粉，發(fā)現(xiàn)GhADF7基因在花粉管中也有強(qiáng)烈的表達(dá)，尤其是在花粉管的尖端。 3.過量表達(dá)棉花GK4DF7基因?qū)е陆湍讣?xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白纖絲（F-actin）異常 將GK4DF7基因在酵母細(xì)胞中過量表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞伸長(zhǎng)。DAPI染色發(fā)現(xiàn)78％的酵母細(xì)胞