Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟影響的研究.pdf

1、Ghrelin是日本科學(xué)家Kojima1999年發(fā)現(xiàn)的一種由28個(gè)氨基酸組成的新的內(nèi)源性腦腸肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的天然配體。Ghrelin與其受體結(jié)合后有著廣泛的生理功能。因此，Ghrelin的研究進(jìn)展是目前人們所關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　隨著動(dòng)物細(xì)胞工程、胚胎工程研究的不斷深入，影響動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟因素的相關(guān)報(bào)道主要是一些生殖激素的相關(guān)作用

2、原理。那么Ghrelin作為生長(zhǎng)激素促分泌素受體的天然配體，它是否參與了綿羊卵母細(xì)胞成熟，是否通過(guò)經(jīng)典的與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用至今未見(jiàn)報(bào)道。由于卵母細(xì)胞在成熟過(guò)程中部分發(fā)生凋亡，而抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax的表達(dá)狀況決定了雌性生殖細(xì)胞存活與否，Ghrelin在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程究竟與Bcl-2和Bax有何關(guān)系目前尚不清楚。針對(duì)以上這些懸而未決的問(wèn)題本論文通過(guò)在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟體系中添加Ghrelin以及G

3、hrelin的受體（GHS-R）特異性拮抗劑D-Lys3-GHRP-6，研究了Ghrelin在綿羊卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的作用，與MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)以及Bcl-2和Bax的關(guān)系，結(jié)果如下：
　　1、Ghrelin受體GHS-R在綿羊卵母細(xì)胞的表達(dá)
　　采用RT-PCR技術(shù)成功檢測(cè)到Ghrelin受體GHS-R在綿羊卵母細(xì)胞的表達(dá)。2、Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞成熟的影響
　　(1)Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞第一極體排出率、核

4、成熟率有促進(jìn)作用。而且呈濃度依賴(lài)性。
　　(2)D-Lys3-GHRP-6作為Ghrelin受體GHS-R的特異性拮抗劑對(duì)卵母細(xì)胞第一極體排出率、核成熟率無(wú)影響。
　　(3)D-Lys3-GHRP-6可阻斷Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的促進(jìn)作用，且對(duì)GHS-R拮抗的越完全，Ghrelin的促進(jìn)作用被阻斷的越顯著。說(shuō)明Ghrelin是通過(guò)與受體GHS-R的結(jié)合而發(fā)揮其對(duì)卵母細(xì)胞的促成熟作用的。
　　3、實(shí)時(shí)熒光定量P

5、CR檢測(cè)Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA表達(dá)的影響
　　(1)Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA的表達(dá)有上調(diào)作用，且存在著明顯的劑量、時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。
　　(2)D-Lys3-GHRP-6對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)MAPK(ERK1/2)、p90rsk mRNA的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　(3)Ghrelin對(duì) MAPK(ERK1/2)、p90rsk

6、mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用可被 Ghrelin受體(GHS-R)拮抗劑D-Lys3-GHRP-6阻斷，且此阻斷作用呈濃度依賴(lài)性。
　　4、Western blotting檢測(cè)MAPK(ERK1/2)、p90rsk蛋白在綿羊卵母細(xì)胞的表達(dá)及Ghrelin對(duì)磷酸化的MAPK(ERK1/2)、p90rsk蛋白表達(dá)的影響
　　(1)MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。
　　(2)卵

7、母細(xì)胞體外成熟10h時(shí)，MAPK（ERK1/2）、p90rsk被激活，直到24h仍維持高活性。說(shuō)明卵母細(xì)胞MAPK（ERK1/2）、p90rsk是在GVBD期后被激活的。
　　(3)Ghrelin對(duì)MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白的表達(dá)有上調(diào)作用。
　　(4)Ghrelin對(duì)MAPK（ERK1/2）、p90rsk蛋白表達(dá)的上調(diào)作用可被D-Lys3-GHRP-6阻斷。
　　(5)在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中p90r

8、sk的激活與MAPK（ERK1/2）一致。
　　(6)Ghrelin在卵母細(xì)胞體外成熟中所起作用是通過(guò)MAPK信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)的，其增加卵母細(xì)胞 GVBD后磷酸化的MAPK（ERK1/2）、p90rsk的表達(dá)是通過(guò) Ghrelin受體介導(dǎo)的。
　　5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響
　　(1)Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)有上調(diào)作用。