豬印記基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、克隆與初步鑒定.pdf

1、在哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞中，某些等位基因不遵循傳統(tǒng)的孟德爾遺傳規(guī)律，表現(xiàn)為單等位基因表達(dá)，這些基因的其表達(dá)具有親源特異性，即只表達(dá)來自父源或母源的等位基因，這類基因稱為印記基因。印記基因的本質(zhì)特征是親源特異性單等位基因表達(dá)，此外印記基因還具有成簇分布的特性，在基因組中通常成簇存在；每個(gè)印記基因簇中都含有至少一個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA和幾個(gè)差異甲基化區(qū)域，二者對(duì)印記基因的表達(dá)具有調(diào)控作用；印記基因的表達(dá)具有時(shí)空特異性，可以在發(fā)育的不同階段或是不同組

2、織中，表現(xiàn)出不同的印記狀態(tài)；大部分印記基因在哺乳動(dòng)物中具有相同的印記狀態(tài)，呈現(xiàn)出物種的保守性?；蚬δ苎芯勘砻?，印記基因在哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要作用，尤其表現(xiàn)在對(duì)胎盤發(fā)育和個(gè)體發(fā)育的影響上。印記基因的異常表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致如生長(zhǎng)過剩綜合征、侏儒癥等多種生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的疾病。在體細(xì)胞克隆中，印記基因的異常表達(dá)，以及印記基因印記控制區(qū)(ICR)的甲基化異常，是造成克隆動(dòng)物發(fā)育異常、流產(chǎn)率高的一個(gè)重要原因。目前為止，印記基因的研究主要集中在

3、小鼠和人上，小鼠中發(fā)現(xiàn)的印記基因多達(dá)144個(gè)，人上為70余個(gè)，并對(duì)其中許多基因進(jìn)行了功能研究和印記控制區(qū)尋找等深入的研究工作。而在豬上，目前已驗(yàn)證的印記基因僅有十余個(gè)，其中具有明確印記控制區(qū)(ICR)信息的只有Igf2/H19印記區(qū)。因此，在豬上對(duì)印記基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)得到的候選基因進(jìn)行克隆和印記鑒定具有重要的意義。
　　 本研究根據(jù)印記基因在哺乳動(dòng)物中具有較高保守性這一特征，利用生物信息學(xué)方法，將小鼠的印記基因序

4、列與豬的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)分析，對(duì)印記基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選獲得候選印記基因；然后對(duì)與胚胎發(fā)育相關(guān)的候選基因進(jìn)行分子克隆，獲得其全長(zhǎng)序列；最后選擇一個(gè)基因，使用“基于cSNP印記驗(yàn)證方法”，對(duì)印記基因的鑒定方法進(jìn)行初步的探索。主要研究結(jié)果如下：⑴在linux系統(tǒng)下，應(yīng)用Blast本地比對(duì)方法，將小鼠的印記基因序列與豬Refseq數(shù)據(jù)和Unigene數(shù)據(jù)構(gòu)成的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，編寫程序?qū)Ρ葘?duì)結(jié)果進(jìn)行解析，獲得了59個(gè)候選印記基因，參照豬已知

5、印記基因，本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果具有較高可信度。⑵通過RT-PCR方法，從豬成纖維細(xì)胞提取的RNA中，克隆獲得四個(gè)候選基因Asb4、Snrpn、Cd81、Grb10的全長(zhǎng)序列。⑶使用“基于cSNP印記驗(yàn)證方法”，對(duì)Asb4基因的印記狀態(tài)進(jìn)行初步鑒定。在大白公豬和長(zhǎng)白母豬Asb4第五個(gè)外顯子77bp處發(fā)現(xiàn)A→G突變，確定為一個(gè)cSNP位點(diǎn)；在其雜交子代F1中，新生豬的臍帶和耳部組織中，該cSNP位點(diǎn)測(cè)序出現(xiàn)雙峰，為雙等位基因表達(dá)，一月齡小豬的16