害蟲捕食性天敵擬環(huán)紋豹蛛煙堿型乙酰膽堿受體毒理學(xué)特性研究.pdf

1、蜘蛛作為農(nóng)田害蟲最重要的捕食性天敵，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中節(jié)肢動(dòng)物群落的優(yōu)勢(shì)類群，其群落結(jié)構(gòu)與功能的特性直接制約著害蟲的發(fā)生與危害，影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑對(duì)蜘蛛類天敵安全，對(duì)蜘蛛的毒性明顯小于甲胺磷和撲虱靈。雖然蜘蛛在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中占有很重要的生態(tài)位，但是，對(duì)于其新煙堿類殺蟲劑的靶標(biāo)--煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors， nAChRs)的研究至今仍是空白。形成鮮

2、明對(duì)比的是，對(duì)昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體的研究近年來(lái)取得了很好的進(jìn)展，這與新煙堿類殺蟲劑的廣泛使用相關(guān)。新煙堿類殺蟲劑不僅毒力高，同時(shí)具備很高的選擇性、安全性，對(duì)哺乳動(dòng)物、天敵蜘蛛比較安全。這些應(yīng)用上的價(jià)值和毒理學(xué)特性上的差異，都促使人們思索并研究新煙堿類殺蟲劑的選擇性機(jī)理，加以應(yīng)用于開發(fā)更好的選擇性殺蟲劑。
　　 本文以稻田蜘蛛的優(yōu)勢(shì)種、重要的捕食性天敵擬環(huán)紋豹蛛為材料，克隆了擬環(huán)紋豹蛛多個(gè)nAChRs亞基，通過(guò)與昆蟲nAChRs

3、相同亞基相比，探索了新煙堿類殺蟲劑在昆蟲與蜘蛛間的毒理學(xué)差異，闡述基于β亞基的選擇性機(jī)理；對(duì)亞基組合進(jìn)行了探索，分析受體的亞基組成與昆蟲nAChRs亞基組成的差異，進(jìn)一步探索新煙堿類殺蟲劑選擇作用的分子機(jī)制，同時(shí)為新型高效高選擇性的殺蟲劑的創(chuàng)制提供理論基礎(chǔ)。
　　 一、擬環(huán)紋豹蛛煙堿型乙酰膽堿受體基因的克隆
　　 采用簡(jiǎn)并引物PCR和RACE技術(shù)首次克隆了害蟲主要捕食性天敵擬環(huán)紋豹蛛7個(gè)煙堿型乙酰膽堿受體基因，這也是首次

4、關(guān)于蛛形綱nAChRs的報(bào)道。其中包括6個(gè)全長(zhǎng)基因和一個(gè)5’-端不全的長(zhǎng)片段。通過(guò)與昆蟲nAChRs亞基序列比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)這些基因與昆蟲的nAChRs亞基具有很高的同源性，其中5個(gè)亞基具有煙堿型乙酰膽堿α亞基的典型特征，2個(gè)具有β亞基的典型結(jié)構(gòu)，此外，7個(gè)亞基基因結(jié)構(gòu)特征分析也顯示，它們均具有煙堿型乙酰膽堿受體亞基的典型特征，如保守的半胱氨酸(α亞基還具有典型的雙半胱氨酸結(jié)構(gòu))、與配基結(jié)合密切相關(guān)的保守氨基酸殘基形成的環(huán)[loopA-

5、C(α亞基),loopD-F(β亞基)]、4個(gè)跨膜片段、信號(hào)肽以及糖基化位點(diǎn)等。因此，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，分別將這7個(gè)基因命名為Ppα1、Ppα2、Ppα3、Ppα6、Ppα7(5’-端不全)、Ppβ1和Ppβ2。
　　 通過(guò)對(duì)擬環(huán)紋豹蛛nAChRsβ1亞基Ppβ1與昆蟲nAChRsβ1亞基氨基酸序列的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Ppβ1與昆蟲的β1亞基具有很高的同源性，但是與配基結(jié)合密切相關(guān)的D,E和F環(huán)上有幾個(gè)重要的氨基酸存在著差異。本文通過(guò)Y

6、ao等（2008年）把桃蚜的β1亞基Mpβ1的三個(gè)環(huán)D、E和F構(gòu)建到鼠的β2亞基上，形成嵌合體β2Mββ1的方法，把Ppβ1亞基的D、E、F環(huán)替代桃蚜β1亞基相應(yīng)的部分，與哺乳動(dòng)物β亞基重組與昆蟲的α亞基構(gòu)建嵌合體在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中共表達(dá)，研究了擬環(huán)紋豹蛛β1亞基D、E、F環(huán)以及環(huán)上一些關(guān)鍵氨基酸變化的影響。
　　 結(jié)果顯示，與桃蚜嵌合體β2Mpβ1相比，把β2Mpβ1的D、E、F三個(gè)環(huán)單獨(dú)或一起由Ppβ1亞基相應(yīng)的環(huán)替代后，

7、吡蟲啉的劑量曲線均發(fā)生了顯著的右移，而對(duì)ACh卻幾乎沒(méi)有影響。進(jìn)一步的研究顯示，與配基結(jié)合密切相關(guān)的D、E、F環(huán)上的單個(gè)氨基酸的改變R81Q、N137G和F190W可能是敏感性發(fā)生變化的主要因素。這是首次在蛛形綱體內(nèi)找到與新煙堿類殺蟲劑選擇性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)。
　　 三、擬環(huán)紋豹蛛煙堿型乙酰膽堿受體的亞基組成
　　 脊椎動(dòng)物nAChRs受體可以以雙型“pair”、三型“triplet”、四型“quadruplet”方式組

8、合，也可以由同一個(gè)亞基組成同型五聚體（Papke et al.，1989; Kuryatov etal.，2000; Mishina et al.,1986; Couturier et al.,1990）。而在昆蟲nAChRs亞基功能研究中，關(guān)于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中nAChRs的亞基組成，即nAChRs五聚體功能單位到底是哪些亞基構(gòu)成的問(wèn)題始終沒(méi)有解決，對(duì)昆蟲nAChRs亞基進(jìn)行各種組合都沒(méi)能表達(dá)出受體功能，即使將來(lái)自于同一種昆蟲的所有亞基共

9、同表達(dá)仍然不成功( Millar，2003)。
　　 本文對(duì)已克隆的擬環(huán)紋豹蛛的2個(gè)α亞基（Ppα1, Ppα2）及2個(gè)β亞基(Ppβ1，Ppβ2)進(jìn)行了體外表達(dá)，結(jié)果表明，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)中，Ppα1， Ppα2與脊椎動(dòng)物的β2亞基共表達(dá)，能夠組成一個(gè)三亞基五聚體受體Ppα1/Ppα2/rβ2。免疫共沉淀的研究結(jié)果表明，在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Ppα1, Ppα2, Ppβ1及Ppβ2四個(gè)