擬南芥LEAFY及龍眼LEAFY同源基因轉(zhuǎn)化雪柑研究.pdf

1、柑桔(Citrus L.)是當(dāng)今世界最重要的水果之一，也是我國南方最重要的經(jīng)濟(jì)果樹。柑桔是多年生木本果樹，以往的常規(guī)育種由于存在童期長、遺傳高度雜合性和多胚現(xiàn)象，使得柑桔育種工作困難重重。近年來，不斷完善的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為我們提供了新的育種和品種改良手段。 目前，轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題受到極大關(guān)注。利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良柑桔品種首先要考慮生物安全性問題，使用安全的選擇標(biāo)記基因是有效方法之一。 本實驗以福建傳統(tǒng)優(yōu)良甜橙品種雪柑(

2、C. sinensis L.Osb.)為材料，在初步建立以PMI(Phospho-mannose-isomerase，磷酸甘露糖異構(gòu)酶)基因為選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因體系基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系；同時將擬南芥LEAFY基因以及龍眼LEAFY同源基因LLFY分別導(dǎo)入雪柑，以期培育童期短的雪柑新品系并研究LLFY基因的功能；本實驗還對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的“針刺”法進(jìn)行了探索研究，為柑桔和木本植物的轉(zhuǎn)基因研究提供了新的思路。主要研究結(jié)果如下： 1.以

3、PMI基因為選擇標(biāo)記雪柑遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。通過對影響轉(zhuǎn)化的各種因素的優(yōu)化實驗建立了雪柑以PMI基因/甘露糖選擇標(biāo)記系統(tǒng)的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。實驗結(jié)果表明，在菌液OD600為0.6，1mg·L-12，4-D預(yù)處理3h，農(nóng)桿菌侵染30min，4d的共培養(yǎng)時間，選擇壓為甘露糖20g·L-1的情況下大大提高了轉(zhuǎn)化后的再生率，而在篩選培養(yǎng)基中加入2mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA的情況下有助于抗性大苗的篩選。 2.LFY和LLF

4、Y基因?qū)胙└痰难芯俊Ｒ詢?yōu)化的條件為轉(zhuǎn)化體系，將擬南芥LEAFY基因以及龍眼LEAFY同源基因LLFY分別導(dǎo)入雪柑中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。研究表明，抗性芽在附加20g·L-1甘露糖和10g·L-1蔗糖的壯苗培養(yǎng)基中能夠有效快速淘汰假陽性抗性芽；通過CPR和PCR檢測，LFY和LLFY基因的大苗轉(zhuǎn)化率分別為：3.7％和7.4％；通過濾紙橋生根法對轉(zhuǎn)基因芽進(jìn)行了生根，獲得完整植株并移栽成功。 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)“針刺法”LFY基因轉(zhuǎn)化雪柑的

5、研究。以雪柑種子為外植體，以pC1301-PMI-LFY重組載體為轉(zhuǎn)化載體，將蘸有農(nóng)桿菌侵染液的接種針在種子胚的頂端分生組織部位刺2～3次，深度1mm左右，當(dāng)實生苗成活后移栽。通過PCR檢測和PCR-Southern雜交檢測得到了1株轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為4.35％。針刺法簡便快速，在雪柑上能夠成功應(yīng)用，為木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的思路。 4.龍眼LFY同源基因LLFY和SLLFY植物表達(dá)載體的構(gòu)建。將紅核子龍眼LLFY基因插入