中華蜜蜂AccMRJP1在大腸桿菌及甲醇畢赤酵母中的表達(dá)及營(yíng)養(yǎng)功能的研究.pdf

1、蜂王漿(royal jelly)是哺育工蜂頭部王漿腺的分泌物，是1—3齡工蜂幼蟲及蜂王的終生食料，有著眾多的營(yíng)養(yǎng)保健和生理活性功能。蜂王漿的神奇功效與它所具有的活性成分密不可分。蜂王漿化學(xué)成分極為復(fù)雜，其中蛋白質(zhì)是主要營(yíng)養(yǎng)成分，含量約占王漿干物質(zhì)的50％，分為可溶性及不可溶性兩大類，可溶性蛋白占王漿總蛋白的82—90％，被稱為主要王漿蛋白MRJPs(maiorroyal jelly proteins)。其中MRJP1是MRJPs含量最豐

2、富，也是目前研究最多的蛋白。它是一個(gè)56KD—57KD的糖蛋白，占MRJPs的4856，被認(rèn)為是與王漿酸同樣重要的王漿質(zhì)量指標(biāo)和功效成分，有著重要研究?jī)r(jià)值。
　　 本研究首先根據(jù)中華蜜蜂(A．cerana cerana)MRJP1(下稱AccMRJP1)序列，從已完成表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tags，EST)測(cè)序的蜂腦cDNA文庫(kù)選出3個(gè)AccMRJP1克隆，通過PCR檢測(cè)和測(cè)序篩選獲得一個(gè)cDNA全

3、長(zhǎng)為1302bp、可編碼433個(gè)氨基酸殘基的AccMRJP1開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，該氨基酸序列與已報(bào)道的AccMRJP1編碼序列(GenBank登錄號(hào)：AY279539)的同源性為99.8％。
　　 其次，將AccMRJP1基因克隆到原核和真核表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌及甲醇畢赤酵母中的表達(dá)。將該AccMRJP1基因克隆到表達(dá)載體pGEX—4T—2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(Escheric

4、hiacoli BL21)中進(jìn)行融合表達(dá)。SDS—PAGE電泳分析顯示一條分子量大小約76kDa，占細(xì)胞總蛋白的17.7％特異性條帶；以GST多抗為一抗作Western blot分析，檢測(cè)到AccMRJP1與GST的融合表達(dá)蛋白印跡，并通過親和柱分離獲得了純化的表達(dá)產(chǎn)物，證明AccMRJP1基因在大腸桿菌中已表達(dá)成功。構(gòu)建了AccMRJP1/pPIC9K真核表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化到甲醇畢赤酵母菌GS115(Pichia pastoris GS

5、115)中進(jìn)行表達(dá)。SDS—PAGE電泳分析表明，表達(dá)的產(chǎn)物在58KDa處出現(xiàn)特異性條帶，分別以His單抗和AccMRJP1多抗為一抗作Western blot檢測(cè)，檢測(cè)到表達(dá)蛋白印跡，說明AccMRJP1基因在酵母菌中也已表達(dá)成功。
　　 此外，還利用AccMRJP1原核表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物作抗原免疫家兔，獲得兔抗AccMRJP1的多克隆抗體，效價(jià)高達(dá)1.6x104，為MRJPs家族其他成員及其基因產(chǎn)物的檢測(cè)提供了一個(gè)有效手段。

6、>　　 最后，用硫酸銨沉淀法分離了AccMRJP1表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)昆蟲細(xì)胞Tn—5B1—4生長(zhǎng)影響進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)表明，AccMRJP1具有一定的營(yíng)養(yǎng)功能，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，有可能代替牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了AccMRJP1原核及真核表達(dá)載體，制備了AccMRJP1多克隆抗體，為發(fā)酵法規(guī)模性生產(chǎn)AccMRJP1、重組蛋白活性的研究及MRJPs家族成員及其基因產(chǎn)物的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，純化的AccMRJP1