大團(tuán)囊蟲草菌發(fā)酵菌絲類雌激素活性研究.pdf

1、大團(tuán)囊蟲草(Cordyceps ophioglossoides)是民間用于治療血崩、月經(jīng)不調(diào)等癥的一類蟲草菌。野生資源的匱乏使得它的研究長期受到阻滯。本論文通過液體發(fā)酵工藝解決資源匱乏的難題，對其發(fā)酵菌絲進(jìn)行了全面的活性組分和動物藥效實(shí)驗(yàn)，揭示了其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并對其類雌激素活性作用機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　 首先，采用形態(tài)學(xué)與分子生物許特征對采集到的菌株進(jìn)行，確證屬于大團(tuán)囊蟲草種。菌種保存在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏

2、管理委員會普通微生物中心，保存編號為：CGMCCNo.1146。本實(shí)驗(yàn)室已獲得國家發(fā)明專利(ZL200410025774.6)，從源頭上保護(hù)這一稀貴藥用資源。
　　 通過其野生生長環(huán)境的分析和其他蟲草類真菌生長條件的資料借鑒，利用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)手段，建立大團(tuán)囊蟲草菌發(fā)酵工藝。較優(yōu)小試發(fā)酵工藝為：培養(yǎng)基蔗糖669．L-1、酵母粉109．L-1、蛋白水解液30 ml-L-1、MgS04.7H200.4 goL-1、KH2P040.4go

3、L-1;搖瓶培養(yǎng)條件為23℃，初始pH5.5，通氣量1:0.6，轉(zhuǎn)速120rpm;針對其中多糖、多酚類以及蟲草酸的產(chǎn)量進(jìn)行了進(jìn)一步的發(fā)酵工藝優(yōu)化，最終得到了有利于此三者產(chǎn)量的優(yōu)化工藝：培養(yǎng)基為葡萄糖75g．L-1，酵母粉5g.L-1，蠶蛹水解液30ml/L，無機(jī)鹽離子為磷酸二氫鈉0.4g.L1和磷酸氫二鉀0.4g．L-1，起始pH為4.0，溫度為23℃；并在小試結(jié)果基礎(chǔ)上成功完成從100L到20噸發(fā)酵放大的研究。優(yōu)化條件也確證了從野生到

4、人工培養(yǎng)的過程中，對天然生長環(huán)境的分析至關(guān)重要。并為下一步的活性成分分析和作用機(jī)理研究提供了基礎(chǔ)。
　　 初步藥理藥效實(shí)驗(yàn)表明菌絲具有較弱的雌激素活性。急性毒副反應(yīng)未明顯顯示。采取中壓液相、高效液相色譜等分離手段對發(fā)酵菌絲主要活性組分進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明其內(nèi)主要活性組分含量分別為蟲草多糖21.8 mg/g、蟲草酸65.89mg/g、總蛋白24.7mg/g、腺苷0.65 mg/g、多酚類21.8 mg/g和黃酮類含量13.2 m

5、g/g干菌粉。研究表明發(fā)酵菌絲具有與許多蟲草類天然和發(fā)酵菌絲相類似的活性成分，特別是多酚類黃酮類含量豐富，人工培養(yǎng)的大團(tuán)囊蟲草菌絲不但安全且具有豐富活性成分。
　　 本論文利用細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)研究了大團(tuán)囊蟲草提取物對雌激素受體陽性和陰性兩株乳腺癌細(xì)胞的生長影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物能夠促進(jìn)雌激素受體陽性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，對雌激素受體陰性的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生長幾乎沒有影響，暗示了我們提取物通過雌激素受體起作用。利用熒光

6、素酶報(bào)告基因ERE-TK-Luc質(zhì)粒的構(gòu)建，進(jìn)一步揭示了提取物在進(jìn)入到細(xì)胞之后能夠使得ERE基因轉(zhuǎn)錄起始，其作用與雌二醇類似但弱于雌二醇，并且和雌二醇有一定的競爭關(guān)系。通過實(shí)時(shí)定量PCR和染色質(zhì)免疫共沉淀的方法進(jìn)行作用途徑的探索，研究表明發(fā)酵菌絲提取物與ER結(jié)合之后能夠激活Myc2，CyclinD，pS2的轉(zhuǎn)錄，在宏觀上表現(xiàn)為類雌激素的活性。對浸提物的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，對DPPH自由基的清除率達(dá)到70％以上，對羥基自由基和超氧自由基的

7、清除率也均能達(dá)到與公認(rèn)的抗氧化藥品效果相當(dāng)。大團(tuán)囊蟲草發(fā)酵菌絲的類雌激素活性作用途徑研究盡管顯示出類似于E2的活性，但其復(fù)合型的作用也暗示了其可能存在多通道多靶點(diǎn)的作用方式，接近于植物雌激素的選擇性作用，安全有效的特點(diǎn)使其很可能成為一種具有雌激素替代治療效用的潛在藥物。
　　 綜上所述，本論文建立了稀有名貴藥用真菌大團(tuán)囊蟲草發(fā)酵工藝，解決野生資源匱乏的問題；解析其發(fā)酵菌絲活性組分并探索藥理學(xué)效果其作用機(jī)理。研究成果為分析藥用真菌