低溫鍛煉對黃瓜幼苗抗冷效應的影響及轉錄因子CBF1的克隆與轉化.pdf

1、黃瓜是重要的蔬菜作物之一，世界各地普遍栽培。黃瓜屬于喜溫作物，早春季節(jié)經(jīng)常受到低溫的危害，日光溫室黃瓜冬春季節(jié)則易受低溫影響。我國勞動人民經(jīng)長期實踐得出了低溫鍛煉能增強黃瓜抗冷能力的經(jīng)驗，多年來的大量試驗也證明了低溫鍛煉確實能增強植物耐冷能力。但選取多低的溫度和多長時間進行鍛煉效果最好，目前尚無定論。植物的一切生命活動均受遺傳物質的控制，目前已從多種植物中克隆出了耐寒基因，其中轉錄因子CBF能激活耐寒基因的表達，CBF超表達能提高植物的

2、耐寒能力。本試驗選取不同低溫對黃瓜幼苗進行鍛煉，以探尋最佳鍛煉溫度及時間。另外從經(jīng)過低溫鍛煉的黃瓜幼苗中克隆出黃瓜CBF1基因，并構建表達載體，成功轉入抗病但不耐寒黃瓜自交系，轉基因植株耐寒能力明顯增強。具體結果如下： 1、以耐寒自交系S11和冷敏感自交系S22為試材，以10/4℃、10/6℃、10/8℃三種溫度處理，對三葉一心期幼苗進行低溫鍛煉。結果表明：10/4℃鍛煉導致黃瓜幼苗SOD、POD、CAT保護酶活性下降，Vc含量

3、降低，根系活力降低，冷害指數(shù)增加，電解質滲透率增加，這說明10/4℃鍛煉已對幼苗造成冷傷害；10/6℃和10/8℃鍛煉使黃瓜幼苗SOD、POD、CAT保護酶活性大幅提高，Vc含量升高，減少了活性氧的危害，可溶性糖和可溶性蛋白含量增加，丙二醛含量下降，冷害指數(shù)顯著降低，根系活力上升，這說明10/6℃和10/8℃鍛煉能增強幼苗的抗冷能力。綜合評價對耐寒自交系S11來說，以10/6℃鍛煉3d效果最好，冷敏感自交系以10/6℃鍛煉2d效果最好。

4、 2、以耐寒自交系S11為試材，研究低溫鍛煉對黃瓜幼苗葉片葉肉細胞超微結構的影響。結果表明：正常條件下的黃瓜幼苗，葉綠體結構完整，基粒多，基粒片層排列緊密，整個膜系統(tǒng)完整。冷脅迫導致葉綠體結構變形，基粒片層松散無序，葉綠體膜受到嚴重損傷，冷脅迫后受傷的膜系統(tǒng)不能立即修復，反而受損傷程度加重。低溫鍛煉增強了黃瓜幼苗抗冷能力，使幼苗在冷脅迫條件下維持膜系統(tǒng)較完整狀態(tài)，葉綠體受損輕，基粒片層排列較緊密，冷脅迫后膜系統(tǒng)修復也較快，這初步

5、說明，適宜的低溫鍛煉使黃瓜幼苗在冷脅迫下維持膜系統(tǒng)，尤其是葉綠體的較完整性，從而減輕了冷傷害。 3、以耐寒能力強的黃瓜‘山農5號’為試材，以擬南芥CBF1基因的保守序列設計引物，通過RT-PCR方法，從低溫鍛煉的幼苗葉片中克隆出黃瓜CBF1基因，該基因長671bp，推導的氨基酸序列為213個氨基酸，與GenBank中的同源序列比較，本試驗克隆的基因與擬南芥的基因在編碼區(qū)完全相同，僅在起始密碼子5'上游存在部分差異，與無包芥、高山

6、離子芥、馬藺等同源性也很高。 用SacI和SacⅡ消化pCBF1，獲得CBF1基因，用SacI和BamHI對pROK2雙酶切，回收大片斷，然后進行連接，構建了黃瓜轉錄因子CBF1基因的正義表達載體，經(jīng)SacI和HindⅢ雙酶切鑒定，證明了該基因已經(jīng)成功連入pROK2中，命名為pROK2-CBF1。該載體的構建，為開展轉基因研究，以提高植物抗寒、抗旱、抗鹽等逆境及基因功能分析，提供了保障。 4、利用花粉管通道途徑轉化的優(yōu)勢

7、，采用子房微量注射的方式，將重組質粒轉化抗病但不耐寒的黃瓜自交系。經(jīng)Kan初步篩選、PCR檢測和Southern雜交檢測，確定有兩株轉基因植株，轉化率為0.05％。不同花齡子房注射的結果表明，以花前一天子房注射效果最好，此時注射出現(xiàn)了轉基因植株。轉基因植株后代出現(xiàn)分離，其分離不符合孟德爾遺傳規(guī)律，可能是由基因沉默所致。但隨世代增加，轉基因植株出現(xiàn)的比率明顯增加。 5、轉基因植株抗冷性明顯增強。T1代轉基因植株經(jīng)苗期低溫脅迫發(fā)現(xiàn)幼

8、苗SOD活性、POD活性比野生型顯著提高，脯氨酸含量、可溶性蛋白含量比野生型大幅提高，而冷害指數(shù)明顯降低，T1代轉基因植株耐寒能力顯著提高。T2代轉基因植株經(jīng)自然低溫檢測，發(fā)現(xiàn)野生型因低溫死亡早。而轉基因植株因低溫致死時間延遲，T2代轉基因植株耐寒能力優(yōu)于野生型。T3代轉基因植株在冬季低溫條件下生長勢明顯優(yōu)于野生型，轉基因植株能安全越冬，而野生型已凍死。轉基因植株抗霜雪病和白粉病能力強，具有野生型同等的抗病性，而抗冷能力明顯增強，至此我