高效三氯乙烯厭氧微生物降解菌群構(gòu)建與分子生物學診斷.pdf

1、城市工業(yè)化的快速發(fā)展，人類活動的加劇，導致地下水受三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)污染的態(tài)勢日益嚴重。鑒于地下水中TCE污染的廣泛性，TCE污染治理已成為國內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注的問題。生物修復技術(shù)具有效率高、成本低、完全降解和無二次污染等優(yōu)點，成為研究人員關(guān)注的TCE污染治理的新技術(shù)。由于上流式厭氧污泥床反應器（upflow anaerobic sludge blanket reactor，UASB反應器）中具有高

2、濃度的微生物和微生物多樣性，因此，與其它的厭氧反應器相比，UASB反應器在難降解有機廢水處理領(lǐng)域更有優(yōu)勢，高濃度的微生物能夠快速地將污染物轉(zhuǎn)化降解。但是，TCE在UASB反應器中的生物降解方面的研究國內(nèi)外罕有報道，以及TCE在厭氧反應器中代謝機理尚不明確。
　　本研究在閱讀大量國內(nèi)外相關(guān)文獻后，針對以上問題，提出以UASB反應器為基礎(chǔ)，在其中構(gòu)建TCE高效降解菌群。展開TCE對厭氧顆粒污泥的產(chǎn)甲烷毒性影響以及顆粒污泥產(chǎn)甲烷活性恢復

3、情況;通過培養(yǎng)和馴化的手段，基于UASB反應器構(gòu)建TCE厭氧降解菌群，探討TCE在UASB反應器中的代謝機理;探索運行參數(shù)對TCE降解效果的影響，利用高通量測序技術(shù)，解析菌群降解TCE過程中各運行參數(shù)的變化對厭氧微生物類群的多樣性以及結(jié)構(gòu)、功能的影響;并對UASB反應器的運行參數(shù)進行優(yōu)化。論文所得的主要結(jié)論如下:
　　(1)雖然TCE抑制甲烷菌的活性，并且抑制作用隨濃度增加而增強;但是，甲烷菌可以逐漸適應TCE的抑制作用，TCE的

4、濃度越大，甲烷菌需要的適應時間就越長;TCE對甲烷菌的抑制作用較強，TCE濃度為10-15mg/L時，屬于中度抑制;TCE濃度高于20mg/L時，屬于重度抑制。當TCE濃度為5-15mg/L時，厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷活性得到恢復，而濃度大于20mg/L時，產(chǎn)甲烷活性并未恢復。
　　(2)通過培養(yǎng)和馴化手段，在UASB反應器中成功獲得TCE厭氧降解菌群，以葡萄糖和乳酸為碳源，TCE處理濃度為14.6-73mg/L時，TCE降解率在85％

5、-90％，TCE的降解產(chǎn)物為順式-二氯乙烯（cis-dichloroethylene，cis-DCE）、氯乙烯(vinyl chloride，VC)和乙烯(ethene)。通過454高通量測序技術(shù)分析TCE厭氧降解菌群的群落結(jié)構(gòu)。菌群中存在Petrimonas、Clostridium、Enterobacter和Lactococcus等多種發(fā)酵產(chǎn)酸菌和能將TCE降解為cis-DCE的厭氧脫氯菌Dehalobacter和Geobacter，

6、以及嗜乙酸甲烷菌（Methanosaeta）(99.54％)，而其他類型的古細菌所占比例很小，不到總序列數(shù)的0.5％。推測菌群在UASB反應器中代謝TCE的機理為:多種發(fā)酵產(chǎn)酸菌（例如:Petrimonas、A cetanaerobacterium、yntrophobacter、Trichococcu、Clostridium、Enterobacter和Lactococcus）發(fā)酵葡萄糖和乳酸成乙酸，并產(chǎn)生H2; Dehalobacter

7、和Geobacter利用H2為電子供體，TCE為電子受體，降解TCE，生成cis-DCE、VC和少量ethene; Desulfovibrio和Syntrophobacter維持厭氧環(huán)境和為厭氧脫氯菌群中的微生物提供必要的營養(yǎng)物質(zhì);Methanosaeta利用發(fā)酵葡萄糖和乳酸產(chǎn)生的乙酸進行產(chǎn)甲烷作用。
　　(3)在溫度為30℃，進水pH值為7.0±0.1，TCE濃度為36.5mg/L，進水COD為3100mg/L的條件下，水力停留

8、時間(hydraulic retention time，HRT)由25h縮短至5h，TCE的處理負荷由35.04mg/L/d增加到175.2mg/L/d，結(jié)果表明:TCE在25h時降解率最大，為99.10％，而在5h時最低，為83.99％;隨著HRT的縮短，TCE處理負荷隨之升高，且HRT的縮短導致進水速度過快，使得菌群與TCE接觸的幾率減小，導致TCE不能夠及時被完全降解，TCE降解率下降。利用Illumima Miseq高通量測序，

9、在不同HRT條件下，在細菌群落中均檢測到Dehalococcoidia的存在，能將TCE徹底降解為ethene的Dehalococcoides sp.均屬于Dehalococcoidia。Lactococcus和Petrimonas在不同HRT條件下均占主導地位，厭氧脫氯菌Geobacter和Dehalobacter的相對豐度隨著HRT的縮短而降低。冗余分析（redundancy analysis，RDA）表明:Lactococcus與

10、TCE的去除率為負相關(guān)，而 Clostridium, Desulfovibrio, Eubacterium,Petrimonas, Syntrophobacter,Thermanaerovibrio與TCE的去除率正相關(guān)。
　　(4)在溫度30℃，為HRT為15h，TCE濃度為36.5mg/L，進水COD為3100mg/L的條件下，進水pH值由6.0逐步提升(6.5，7.0)至7.5時，菌群的活性逐漸增強，TCE降解率隨之提高。T

11、CE降解率在進水pH值7.0下最大，為96.76％，而在6.0時最低，為79.33％;而且，pH值小于7.0時TCE的降解率明顯小于pH值大于7.0時TCE的降解率，說明pH值小于7.0的偏酸環(huán)境對菌群的活性影響較大。在不同pH條件下，在細菌群落中均未檢測到Dehalococcoidia的存在。由于Lactococcus和Petrimonas為發(fā)酵產(chǎn)酸菌，因此它們在不同pH條件下均占主導地位，厭氧脫氯菌Geobacter和Dehalob

12、acter的相對豐度隨著pH的提升而增加。而在pH為6.0時，未檢測到Dehalobacter的存在，并且Geobacter豐度較低(0.81％)，這可能是TCE的降解率在pH為6.0時最低的原因。RDA分析表明:Lactococcus與TCE的去除率為負相關(guān)，而Propionicicella，Petrimonas，Syntrophobacter和Thermanaerovibrio與TCE的去除率正相關(guān)。
　　(5)在HRT為15

13、h，TCE濃度為36.5mg/L，進水COD為3100mg/L，進水pH值為7.0±0.1的條件下運行，溫度由20℃逐步提升(25℃，30℃)至35℃時，TCE降解率隨之提高，TCE降解率在30℃下最大為97.89％;而溫度提升到40℃時，菌群的活性受到抑制，TCE降解率只有77.90％，溫度的升高使得菌群中可以適應溫度改變的類群逐漸成為優(yōu)勢種，進而提高了對TCE的降解效能，過高的溫度，菌群的活性下降，使菌群對TCE的降解效能下降。溫度

14、為25℃-40℃時，在細菌群落中檢測到Dehalococcoidia的存在。溫度為20℃-30℃時，厭氧脫氯菌Geobacter和Dehalobacter的相對豐度隨著溫度的提升而增加;在40℃時，未檢測到Dehalobacter的存在，并且Geobacter豐度較低(1.76％)，這可能是TCE的降解率在40℃最低的原因。RDA分析表明:Lactococcus，Syntrophobacter，Desulfovibrio，Petrimo

15、nas,Clostridium和 Blvii28 wastewater-sludge group與TCE的去除率為負相關(guān)，而只有Thermanaerovibrio與TCE的去除率正相關(guān)。
　　(6)采用響應面法中的中心組合設計對HRT、溫度和進水pH值等UASB反應器的運行條件進行優(yōu)化。通過模型預測的最優(yōu)UASB反應器運行條件為HRT為19.44h，溫度為31.07℃，進水pH為7.13時，TCE去除率達到96.52％，以模型預測