棉花(Gossypium Hirsutum)水孔蛋白基因克隆、表達及功能研究.pdf

1、棉纖維是世界上重要的紡織原料。纖維細胞是由胚珠外表皮細胞分化而來的不分枝的單細胞毛狀突起，其生長發(fā)育可分為四個發(fā)育階段：纖維起始、伸長、次生壁合成及脫水成熟。棉纖維細胞發(fā)育的分子機制研究一直備受關(guān)注，近年來已經(jīng)分離克隆了大量纖維發(fā)育相關(guān)基因，并對其中一些基因的功能進行了較為深入的研究。但是，有關(guān)纖維發(fā)育過程中水分運輸及其調(diào)控機制的研究，仍較少有報道。水孔蛋白是存在于生物膜上的一類古老的通道蛋白，介導水分快速跨膜運輸，在植物整個生長發(fā)育和

2、環(huán)境應答過程中都起著重要作用。為研究水孔蛋白在棉花中的功能，尤其是在棉纖維細胞發(fā)育及逆境應答過程中的作用，我們從棉花中分離克隆了10多個水孔蛋白基因（包括12個質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因和1個液泡膜內(nèi)在蛋白基因），并對這些基因的結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控及其編碼蛋白的活性、細胞亞定位和功能進行了研究。取得如下研究結(jié)果： 1.從棉花cDNA文庫中分離克隆了12個編碼質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因的cDNA，通過序列比較和進化分析發(fā)現(xiàn)其中4個屬于PIP1亞類基因，依次

3、命名為GhPIP1；1，GhPIP1；3，GhPIP1；4GhPIP1；5；另外8個屬于PIP2亞類，依次以GhPIP2；1～GhPIP2；8命名。同時，利用PCR技術(shù)，從棉花基因組中克隆了7個GhPIP基因的全長序列，與cDNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)，其中5個基因（GhPIP1；5，GhPIP2；3，GhPIP2；4，GhPIP2；7，GhPIP2；8）由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，而GhPIP1；3和GhPIP2；6基因只含有2個內(nèi)含子。

4、所有基因的內(nèi)含子插入的位置高度保守。 2.蛋白活性檢測發(fā)現(xiàn)，所檢測的9個GhPIP蛋白都具有水通道活性，其中3個GhPIP1蛋白的活性較低，而GhPIP2都具有較高的活性。GhPIP2；3和GhPIP2；4活性最高，它們都對汞離子敏感。 3.利用GFP熒光蛋白共定位技術(shù)研究了GhPIP蛋白的細胞亞定位。構(gòu)建了GhPIP1；4和GhPIP2；4基因與eGFP的融合表達載體并轉(zhuǎn)化棉花，獲得表達GFP熒光蛋白的轉(zhuǎn)化愈傷組織，激

5、光共聚焦顯微鏡觀察表明，這兩個蛋白均定位在細胞質(zhì)膜上。 4.GhPIP基因在棉花中的表達具有組織差異性，其中4個基因（GhPIP2；3～GhPIP2；6）在纖維中優(yōu)勢表達，并受纖維發(fā)育調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要集中在伸長期的棉纖維中。利用水孔蛋白的活性抑制劑--HgCl2處理棉花離體胚發(fā)現(xiàn)，HgCl2能顯著抑制纖維細胞的伸長，纖維長度明顯下降；而用HgCl2和HgCl2的抑制劑--β-巰基乙醇同時處理棉花離體胚，纖維長度比HgCl2單

6、獨處理時有所恢復。另外，在酵母中異源表達GhPIP2；3等基因能促使宿主細胞異常的縱向伸長，細胞長度是對照的1.30～2.18倍。以上結(jié)果表明，GhPIP2；3等4個GhPIP2基因在棉纖維伸長過程中起重要作用。 5.GhPIP1；3基因在6～15 DPA胚珠中特異表達，在9 DPA胚珠中表達量達到最大值。開花后6～15天是胚珠質(zhì)量增長的對數(shù)期，這表明GhPIP1；3可能在棉花胚珠快速增長的過程中起作用。利用分子克隆技術(shù)和農(nóng)桿菌

7、介導的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了GhPIP1；3基因的RNAi載體并轉(zhuǎn)化棉花，目前已得到了來自5個胚細胞系的13棵轉(zhuǎn)基因棉花植株，有關(guān)分析正在進行中。 6.除上述5個基因以及GhPIP2；7外，其余6個GhPIP基因均在根中優(yōu)勢表達。Northern雜交和實時定量RT-PCR結(jié)果顯示GhPIP1；1，GhPIP2；1，GhPIP2；2主要在幼嫩的根（3天）中表達，而在較成熟的根中（6～14天），其表達量顯著下降；另外，這3個基因在不