血培養(yǎng)vs分子生物學解析

1、2024/2/4,血培養(yǎng),VS,分子生物學,血流感染快速分子診斷,分子診斷不受抗菌藥物使用的影響血培養(yǎng)陽性后分子診斷直接使用血標本進行分子診斷快速但不能提供藥敏結果,血培養(yǎng)陽性瓶分子鑒定,Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,陽性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測,PCR特異性檢測病原特異性PCR特定耐藥基因檢測：葡萄球菌mecA, 腸球菌van

2、細菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒A基因lytA拷貝數廣譜檢測：PCR擴增特定靶位多態(tài)性分析測序后續(xù)基因檢測種特異性real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):137,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌,5,Target：ecfX gene血培養(yǎng)系統(tǒng)：BacT/ALERT，

3、87瓶FA、13瓶FN，涂片均顯示G-b對照方法：氧化酶，API 20EDNA提?。?.5ml肉湯，離心后加裂解液，水煮法定量PCR：擴增：Oligonucleotide primers基因特異性檢測：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠

4、假單胞菌,6,33瓶pae，敏感性和特異性均為100%1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)≤kpn (108CFU/ml)，PCR(-)檢測限：將ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,,陽性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測,最常見病原體多重PCR電泳譜、ELISA雜交、多重Real-time PCRHyplex

5、 BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微陣列分析，檢測多種病原及mecA，3h完成多重Real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,血培養(yǎng)陽性－多重real-time PCR

6、,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽性－多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培養(yǎng)陽性－PNA FISH核酸熒光原位雜交,10,血培養(yǎng)陽性肉湯　　革蘭染色　　PNA FISH,革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeEfa/其它腸球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌報道Salmonella spp.

7、90min PNA FISH完成,,Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,MALDI-TOF MS,基質輔助激光解析電離（MALDI）原理：將樣品分散在基質分子中形成結晶后直接進樣，當用激光照射結晶時，基質吸收了激光的大部分能量，使基質分子和樣品獲得能

8、量投射到氣相并得到電離，成為帶電荷的離子?；|在樣品離子形成過程中起到了質子化或去質子化的作用，使樣品帶上正電荷或負電荷，成為帶電荷的離子基質會干擾被檢測分子質譜峰的大小和濃度；不同類型的分析物選擇不同的基質,MALDI-TOF MS,飛行時間（TOF）原理：離子源產生的離子在加速電場獲得動能，當進入高真空無電場飛行管道并在此管道內飛行時，質量較輕的離子飛行速度快，早到達檢測器；質量較重的離子飛行速度慢，晚到達檢測器。因此依據離子

9、的飛行時間與其質荷比平方根（m/z）成正比的關系，通過測定飛行時間，計算出相應離子的分子量。,MALDI-TOF MS操作步驟,MALDI-TOF MS快速鑒定陽性血培養(yǎng),14,使用菌落、陽性血培養(yǎng)肉湯鑒定快速：20分鐘(從報警到鑒定出結果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，284/319陽性菌(89.02%)80.9%復數菌正確鑒定出一

10、種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):388個陽性瓶，種正確率91%（包括念珠、厭氧菌）15瓶復數菌：使用通用庫多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽性庫分析，6瓶鑒定出第二種菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631　J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,MALDI-TOF MS,1

11、5,VITEK MS(bioMérieux)以16s為金標準，980株臨床分離株，ID正確率腸桿菌科97.7%非發(fā)酵菌92%葡萄球菌屬94.3%鏈球菌屬84.8%HACEK84%酵母菌85.2%,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,PCR/ESI MS,廣譜PCR－ESI MS（電噴射質譜）189陽性血培養(yǎng)和45陰性血培養(yǎng)，一致率98.7%6例spn標本方法陰性提供定量結果－－

12、評估病原體載量假陰性率24%：幾乎均由混合感染導致5-6h完成檢測結合PCR的敏感性和ESI MS特異性可以直接檢測標本，不需要培養(yǎng),Proc Natl Acad Sci. 2005;102:8012,血標本分子檢測,種特異性、屬特異性、廣譜、多重PCR、微陣列分析血培養(yǎng)陰性的苛養(yǎng)菌，如Bartonella spp.巴爾通體, Coxiella burnetii伯氏考克斯體, Mycoplasma spp.支原體, Chlam

13、ydia spp.衣原體, Ricketssia spp.立克次體，Tropheryma whipplei,商品化分子生物學檢測方法:血標本,18,SeptiFast®(Roche)：multiplex real-time PCR，種屬特異性熒光探針，檢測重要血流感染致病菌SepsiTestTM® (Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and

14、 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，幾乎可以鑒定所有細菌、真菌VYOO® (SIRS Lab)：multiplex PCR，檢測重要血流感染菌，電泳分離擴增片段Plex-ID® (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+質譜，幾乎可以鑒定所有細菌、真菌,Intensive Care Med. 2011 May, publ

15、ish online.,SeptiFast test檢測的病原譜,BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:49–56,SeptiFast test評估,Intensive Care Med (2010) 36:49–56,,,SeptiFast與PCT、CRP相關性,Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447–455,VYOO®檢測

16、能力評估,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,Sepsis,非感染SIRS,血培養(yǎng)陽性,血培養(yǎng)陰性，其它標本培養(yǎng)陽性,Sepsis,所有培養(yǎng)陰性,VYOO®,與微生物學一致性為46.2%仍需改進,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,3種商品化PCR檢測系統(tǒng)比對,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,3種商品化PCR檢測系統(tǒng)比對,Med Klin Intensivm

17、ed Notfmed 2013,分子生物檢測血標本,26,幾乎所有與血培養(yǎng)對照的研究，都顯示更高的敏感性，但并非所有血培養(yǎng)陽性菌一定能檢測出來不可替代血培養(yǎng)！相較于血培養(yǎng)，其高敏感性可以更早地開始抗菌治療，或改變治療方案污染導致的假陽性無法排除！評估血培養(yǎng)陰性的PCR陽性結果分析其它微生物檢查結果（如BALF，傷口拭子等）免疫反應指標,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.