綜合實訓(xùn)革蘭陰性需氧和兼性需氧桿菌

1、革蘭陰性需氧和兼性厭氧桿菌,xiaobinxuer@163.com,革蘭陰性需氧和兼性厭氧桿菌,革蘭陰性桿菌,O-F試驗,F,－,,,,o/－,非發(fā)酵菌,氧化酶試驗,+,弧菌科,腸桿菌科,革蘭陰性菌初步分群,乳糖發(fā)酵試驗,A腸桿菌科共同特性,1、相似的形態(tài)染色 中等大小，G –桿菌，無芽胞，多數(shù)有動力,2、簡單的培養(yǎng)條件,3、活潑的生化反應(yīng),初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌,腸道致病菌,腸道非致病菌,不發(fā)酵乳糖,發(fā)酵乳糖,,,A腸桿菌科

2、的鑒別,1、形態(tài)觀察（革蘭染色） G –桿菌2、菌落觀察（1）埃希菌在腸道 選擇性培養(yǎng)基上發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在SS和MAC平板上為紅色或粉紅色菌落(2)志賀菌屬：將本菌接種在SS和MAC平板上經(jīng)35℃孵育18～24h。由于志賀菌不分解乳糖，宋內(nèi)志賀菌某些菌株可遲緩發(fā)酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成無色透明的、中等大小的菌落。除宋內(nèi)志賀菌菌落外均為光滑型菌落。 (3)沙門菌屬：將本菌接種在SS、MAC平板上經(jīng)35℃孵育18～2

3、4h。由于本菌不分解乳糖并產(chǎn)堿，故在SS和MAC平板上形成無色、半透明、光滑濕潤、凸起的小菌落，產(chǎn)生H2S的菌落可在SS平板上形成中心帶黑褐色的小菌落。3、生化反應(yīng)4、血清學(xué)實驗,革蘭陰性桿菌，有周身鞭毛。發(fā)酵多種糖類，多數(shù)能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣 IMViC試驗為+ + - -，MIU:++-, KIA:AA+-不產(chǎn)H2S大腸桿菌血清型以O(shè)：K：H,A1埃希菌,能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖,除宋內(nèi)志賀菌

4、IMViC試驗為-+ - -，MIU:---, KIA:KA--,不產(chǎn)H2S,是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，,通稱痢疾桿菌dysentery bacteria,無鞭毛，有菌毛,生化反應(yīng),形態(tài),,,A2志賀菌,低于其他腸道桿菌，對酸敏感,對理化因素的抵抗力,,血清學(xué)：根據(jù)生化反應(yīng)特征和O抗原分為4群,,肝脾-腫大膽囊-腸道-排菌(2周）腎臟-尿-排菌（3周),A3傷寒、副傷寒的致病過程,傷寒沙門菌和甲型副傷寒桿菌、肖氏沙門菌

5、、希氏沙門菌,腸粘膜上皮細(xì)胞,腸系膜淋巴結(jié),固有層淋巴結(jié),進(jìn)入血液,再次進(jìn)入血液,,,,,,第一次菌血癥發(fā)熱,不適,全身疼痛,第二次菌血癥（1周）高熱、外周白細(xì)胞下降、肝脾腫大、表情冷漠、玫瑰疹、相對緩脈,,肝臟脾臟膽囊腎臟骨髓,并發(fā)癥腸穿孔腸出血,典型病例病程為3-4W,胸導(dǎo)管,,,微生物學(xué)檢查法,細(xì)菌學(xué)診斷標(biāo)本：胃腸炎取糞便嘔吐物或可疑食物腸熱癥在病程不同階段采取不同標(biāo)本； 發(fā)病1周取血；發(fā)病1-3

6、周取骨髓液 發(fā)病2 周取糞便；發(fā)病3周取尿,微生物學(xué)檢查,細(xì)菌學(xué)診斷,標(biāo)本,SS平板,生化反應(yīng),血清學(xué)鑒定,,,,沙門菌生化反應(yīng),KIA:K/A-+,H2S陽性,賴氨酸脫羧酶陽性,IMVC:-+-+,MIU:+--,沙門菌血清學(xué)鑒定—肥達(dá)氏反應(yīng),一、原理 用已知的標(biāo)準(zhǔn)診斷菌液【傷寒桿菌：菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原；副傷寒甲、乙、丙鞭毛（H）抗原共5種】與受檢血清作試管凝集試驗，測定受檢血清中有無

7、相應(yīng)抗體及其效價，以協(xié)助傷寒、副傷寒疾病的診斷。二、器材及試劑 標(biāo)準(zhǔn)診斷菌液（5種抗原：10ml/瓶）、生理鹽水（N.S）、待檢血清（兔血清）、試管、試管架、加樣槍或移液管（5mL、2mL、0.5mL每組3支）、一次性塑料滴管等。,1,三、實驗方法1. 冰箱中取出診斷菌液平衡至室溫。2. 將待檢血清作1：20、1：40、…..1：1280（每管0.5ml，每個稀釋倍數(shù)5管）稀釋，對照管 加N.S 0.5ml

8、,然后逐管加入混勻后診斷菌液1d， 充分振蕩混勻，標(biāo)記（時間、班級、組號），35~37°C放置16-20h觀察結(jié)果。（配液管：0.25ml血清+4.75mlN.S=5.0mL: 1：20）3. 5/6個同學(xué)一組，第二天中午1:30觀察結(jié)果。,1:1280,傷寒O抗原,0.25ml血清+4.75mlN.S=5.0mL: 1：20,,,2.5ml,,2.5ml,,2.5mlN.S,,余2.5ml,,平分為5管，每管0

9、.5ml：得5管1:20稀釋倍數(shù)的血清,,平分為5管，每管0.5ml：得5管1:40稀釋倍數(shù)的血清,2.5mlN.S,,,,,,,余2.5ml,1:1280,,,,,,,,傷寒H抗原,副甲H抗原,副乙H抗原,副丙H抗原,,,,,,,,1:1280,傷寒O抗原,0.25ml血清+4.75mlN.S=5.0mL: 1：20,,,,四、凝集結(jié)果判斷（上清液、沉淀）“＋＋＋＋”：強(qiáng)，完全凝集，液體澄清，輕搖大片凝

10、 集塊。 “＋＋＋”：大部分凝集，液體輕度渾濁，凝集塊 小。 “＋＋”：中強(qiáng)，部分凝集，液體半澄清，凝集塊 顆粒狀。 “＋”：弱，少量凝集，液體渾濁。 “－”：不凝集，液體渾濁，和對照相同。,++++,,++ +++,,五、效價判斷 能出現(xiàn)明顯凝集（++）的

11、血清最高稀釋度。例：測定某病人“O”凝集效價結(jié)果如下：1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 4+ 3+ 3+ 2+ 2+ + -,六、臨床意義 1.正常值：正常人血清中可能有低效價的抗體存在，其值高低存在地區(qū)差異，一般傷寒沙門菌“O”>1:80,“H”>1:160,副傷寒沙門菌“H”>1:80，有臨床意義；或

12、者進(jìn)行疾病早期、中后期兩次血清效價比較，后者增高4倍/4倍以上有診斷價值。2. “O”抗體出現(xiàn)早、消失快、主要為IgM類；“H”抗體出現(xiàn)遲、可持續(xù)陽性數(shù)年，主要為IgG類，O、H凝集效價都超過正常值，意義較大。1）、“O”高“H”不高：感染早期，傷寒沙門菌“O”抗 原有交叉反應(yīng)，建議一周后復(fù)查。2）、“H”高“O”不高：疾病晚期、預(yù)防接種、非特異 性回憶反應(yīng)。,3.傷寒、副傷寒甲、乙有部分共同

13、的O抗原，如O抗體效價增高，只能推斷為傷寒類疾病，不能區(qū)別傷寒或副傷寒。4.陰性反應(yīng)：未感染，感染輕，應(yīng)用有效抗菌藥物，接受皮質(zhì)激素治療者，患者過于衰弱等。七、注意事項 1.應(yīng)在光亮處先觀察管底凝集狀態(tài)，后輕搖判 定結(jié)果。 2.使用前搖勻菌液，菌液有搖不散的凝集塊時不能使用。,B弧菌科,弧菌科(Vibrionaceae)是一群氧化酶陽性，具有端極鞭毛，菌體短小、直或微彎的革蘭陰性桿菌。分為弧菌屬、氣單胞菌屬

14、、鄰單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬等四個菌屬。弧菌屬特征：耐堿不耐酸，營養(yǎng)要求不高。生長迅速, 在pH8.8~9.0的堿性蛋白胨水/堿性瓊脂平板上生長良好。在TCBS平板上為黃色菌落; 在含亞碲酸鉀的平板上形成中心灰褐色的菌落。多數(shù)菌株生長都需要鹽；大多數(shù)氧化酶都為陽性；具有一端單一鞭毛。,,TCBS平板上菌落,,含亞碲酸鉀的4號平板,弧菌科細(xì)菌及相關(guān)細(xì)菌的特征,,C非發(fā)酵菌,不發(fā)酵革蘭陰性桿菌包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、無色桿菌屬、不動

15、桿菌屬、莫拉菌屬、金氏桿菌屬、黃桿菌屬、艾肯菌屬、土壤桿菌屬、黃單胞菌屬、叢毛單胞菌屬等。假單胞菌屬為需氧、有鞭毛、無芽胞、無莢膜的革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗陽性。代表菌株為銅綠假單胞菌。,OF試驗：O氧化酶：+精氨酸水解：+葡萄糖酸氧化：+　　　　氮?dú)猓?,假單胞菌鑒定程序,,銅綠假單胞菌,1、形態(tài)觀察：G- 桿菌，多形性，有鞭毛、菌毛、莢膜，無芽孢,產(chǎn)熒光素和綠膿素,2、培養(yǎng)特性：專性需氧，4℃不生長42 ℃生長，在血平板上