半乳糖苷酶

1、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶,第一節(jié) 糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferases),糖基轉(zhuǎn)移酶是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶。負責(zé)將活性供體(通常是NDP-糖)的單糖轉(zhuǎn)移到糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸分子上，完成糖基化反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的糖基轉(zhuǎn)移酶有100多種，其主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。,一、糖基轉(zhuǎn)移酶的命名與分類,糖基轉(zhuǎn)移酶的傳統(tǒng)分類方法是根據(jù)其所轉(zhuǎn)移的單糖類型進行分類的。如半乳糖轉(zhuǎn)移酶，唾液酸轉(zhuǎn)移酶等。另外

2、一種方法是根據(jù)序列的同源性、底物/產(chǎn)物立體化學(xué)異構(gòu)性以及供體糖進行分類。這種分類法糖基轉(zhuǎn)移酶被分為66個家族及一個未分類族。所有家族只采用兩種折疊方式，形成了兩個超家族，分別為GT-A和GT-B超家族。,糖基轉(zhuǎn)移酶的命名,GlcNAc T-I的全稱為：UDP-N-乙酰葡糖胺:?-3-甘露糖基?-1,2N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。GlcNAc T-II的全稱為：UDP-N-乙酰葡糖胺: ?-6-甘露糖基?-1,2N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。

3、,?-1,4-Galactosyltransferase Family,Fucosyltransferase Family,All members of the sialyltransferase genes cloned,The Evolutionary History of Glycosyltransferase Genes,后生動物,后口動物,脊椎動物,哺乳動物,原始昆蟲,無脊椎動物,非哺乳動物,二、糖基轉(zhuǎn)移酶特性,一個基因 ?

4、一種轉(zhuǎn)移酶 ? 一種連接鍵糖鏈的合成不是由基因編碼合成的，而是由基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶通過糖基化作用，將糖基由其供體轉(zhuǎn)移到受體上完成的。每個糖基轉(zhuǎn)移酶都有自己特異供體、受體和聯(lián)接鍵，這就保證了在沒有模板的情況下合成特異性的糖。糖鏈可以認為是基因的次級產(chǎn)物, 一個基因編碼一個糖基轉(zhuǎn)移酶, 一個糖基轉(zhuǎn)移酶專一地催化一個糖苷鍵的合成，一條糖鏈的合成就需要一個多酶系統(tǒng), 也就對應(yīng)了一個基因組。,糖基轉(zhuǎn)移酶特性,糖基轉(zhuǎn)移酶絕大部分是II型膜

5、結(jié)合蛋白，即較短的N-端在胞漿，有一穿膜部分通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體膜，長的C-端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的管腔內(nèi)。有少數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶是I型膜結(jié)合蛋白，其較短的N-端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而很長的C-端則定位于胞漿。,Biological Functions of a Soluble Form of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V),Regulation of High Branching in N-l

6、inked Oligosaccharides,大鼠不同組織中三種Ｎ-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(GlcNAc T),三、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域,屬于II-型膜結(jié)合蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶分成四個結(jié)構(gòu)域。氨基端的胞漿域，一般少于25個(最少4個)氨基酸，含正電荷的堿基氨基酸較多；穿膜域，有少量氨基酸殘基，富含疏水氨基酸；頸區(qū)域，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體管腔內(nèi)，含甘氨酸和脯氨酸殘基，有的帶有N-糖鏈。,糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域,催化域，為管腔中的最大結(jié)構(gòu)域，呈球狀

7、，約含310-430個(最長可達720個左右)氨基酸殘基，為糖基轉(zhuǎn)移酶最重要的催化區(qū)域。,克隆的哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域,四、糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性與功能,(1)底物專一性糖復(fù)合物中糖基的順序和連接鍵是由糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性和催化特性來決定的。對底物專一性，一個酶的產(chǎn)物常作為下一個酶的底物，這樣就保證了糖鏈中糖基的特定順序。因合成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同或合成的部位不同，所用的供體和受體也不同。,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,合成糖原時，葡萄糖的

8、供體是UDP-Glc，合成淀粉時，則是ADP-Glc，合成纖維素時是GDP-Glc。對受體的專一性，在糖蛋白的N-糖苷鍵連接的糖鏈的外周有6種不同的方式連接的N-乙酰葡糖胺(GIcNAc),它們連接在不同甘露糖基(Man)的不同糖基上，分別有6個不同的糖基轉(zhuǎn)移酶負責(zé)它們的轉(zhuǎn)移，每個酶又對應(yīng)不同的受體 。,不同的糖基轉(zhuǎn)移酶所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)不同,人B血型的?1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對受體底物的專一性,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,唾液酸化Lewi

9、s X四糖抗原合成時，一般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺，再由?-1,3Fuc T在G1cNAc上加入Fuc，而不能先合成巖藻糖化的N-乙酰乳糖胺后再加上NeuAc。因?-2,3 NeuAc T不能以?-1,3巖藻糖化糖鏈為底物。,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,糖基轉(zhuǎn)移酶也可作用于人工底物，如參與糖蛋白糖鏈合成的糖基轉(zhuǎn)移酶也可利已除去蛋白質(zhì)而還原末端標記(熒光和放射性核素)的底物。不少糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的識別實際上只涉及受體底物中接受糖基鄰近的

10、少數(shù)糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作為這些酶的底物。,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,,(2)二價金屬離子的需求大多數(shù)的糖基轉(zhuǎn)移酶都需二價金屬離子作為輔助因子，缺乏二價金屬離子時(如在EDTA存在下)酶活力很低或喪失。二價金屬離子中Mn2+的激活作用最強，其次是Co2+,Mg2+,Ni 2+。糖基轉(zhuǎn)移酶 T-V不需要二價金屬離子。,五、糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性,糖基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)構(gòu)上的最大特點是不同糖基轉(zhuǎn)移酶一級結(jié)構(gòu)之間的同源性很少，即使

11、轉(zhuǎn)移相同糖基的糖基轉(zhuǎn)移酶也很少有同源性。血型A抗原的GalNAc T和血型B抗原的Gal T同源性達99％，在353個氨基酸殘基中只有4個不同。,糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性,不同種屬中同一糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性極大，其催化結(jié)構(gòu)域的同源性一般均在80％以上。如人、小鼠和兔中?-1,2GlcNAc T-I四個結(jié)構(gòu)域的同源性分別為100%、90%、80%和95%。,六、糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,?-1,3 T的活性在人體內(nèi)的重現(xiàn)會引發(fā)自身免疫反應(yīng)。相反

12、，如果人體內(nèi)?-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白G (IgG)分子中的糖鏈半乳糖含量降低。它能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，從而也會出現(xiàn)自身免疫，其癥狀是類風(fēng)濕。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,細胞癌變過程中常伴有糖鏈結(jié)構(gòu)改變，如糖鏈分支末端出現(xiàn)重復(fù)N-乙酰半乳糖胺結(jié)構(gòu)、唾液酸和巖藻糖含量增加，這些變化在臨床上常用作腫瘤標記物。糖基轉(zhuǎn)移酶就是通過影響糖鏈的改變，而間接關(guān)系到癌瘤發(fā)生和發(fā)展。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,糖基轉(zhuǎn)移酶的表達和細胞周期密切相

13、關(guān)。在細胞分化階段，如果糖基轉(zhuǎn)移酶在成熟細胞中活性很高，就會產(chǎn)生癌變，同時出現(xiàn)早期的分化抗原。多聚N-乙酰半乳糖胺鏈的出現(xiàn)被看成是腫瘤的重要標志。這些糖鏈可以減低細胞與基質(zhì)間的粘著，有利于癌細胞的進一步侵入。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,與肝癌發(fā)生有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌中活性有明顯改變，如GnT-Ⅳ、GnT-Ⅴ和?-1, 6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。GnT-Ⅳ和GnT-Ⅴ能將一個N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移至N-糖鏈五糖核心1, 3和1, 6臂甘

14、露糖上,分別形成?-1,4和1,6鍵，使N-糖鏈天線數(shù)增多，?-1, 6 FucT則將巖藻糖轉(zhuǎn)移至糖鏈最內(nèi)側(cè)(與天冬酰胺相鄰)的N-乙酰葡糖胺上形成核心巖藻糖。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,這些結(jié)構(gòu)異常的糖鏈出現(xiàn)在腫瘤細胞的糖蛋白上，使腫瘤細胞表面性質(zhì)變化，導(dǎo)致細胞粘附、侵襲和遷移能力改變，是造成腫瘤細胞具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的一個重要原因。,七、糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌研究中的應(yīng)用惡性腫瘤中糖基轉(zhuǎn)移酶表達及活性改變所致腫瘤細胞表面糖鏈

15、結(jié)構(gòu)的變化在腫瘤的診斷、預(yù)防方面有重要意義。將糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染入肝癌細胞，過表達的糖基轉(zhuǎn)移酶使細胞內(nèi)某些蛋白發(fā)生糖基化,產(chǎn)生不同糖型，通過雙向電泳和凝集素免疫印跡相結(jié)合，比較轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組糖蛋白改變，從而確定蛋白質(zhì)和糖基化的功能關(guān)系,研究為糖基化改變在肝癌發(fā)生中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。,糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,采用同樣技術(shù)路線研究與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的糖基化改變，并從結(jié)構(gòu)上描述糖鏈，旨在將其作為乳腺癌和其他實體腫瘤診斷工具和免疫治療靶點。,糖

16、基轉(zhuǎn)移酶在糖類合成中的應(yīng)用糖類藥物在治療炎癥、用作腫瘤疫苗和抗病毒等方面都有其獨特的功效。現(xiàn)在普遍使用的糖類合成方法有兩種： 化學(xué)合成和酶促合成化學(xué)合成近年來取得一些進展，提出了一種全自動寡糖合成法，但在天然復(fù)合產(chǎn)物中以一種糖代替另一種糖仍然困難。酶促合成的產(chǎn)量高、產(chǎn)物具有特異立體化學(xué)異構(gòu)性。,糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,糖基轉(zhuǎn)移酶可作為研究糖復(fù)合物工具如研究糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及細胞表面糖基化修飾等。,

17、八、O-GlcNAc 糖基轉(zhuǎn)移酶在原核和真核細胞中的表達和提純,南通醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室與美國紐約州立基礎(chǔ)研究所神經(jīng)生化系合作。O-GlcNAc 糖基化修飾起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，在生命過程的許多方面起作用(如核運輸，基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過程)。OGT 基因敲除實驗表明蛋白質(zhì)O-GlcNAc 糖基化修飾是胚胎干細胞存活和個體發(fā)育所必需的。蛋白質(zhì)的O-GlcNAc 糖基化修飾還調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)的O-GlcNAc 糖基化與磷酸化修飾

18、間存在相互競爭、相互補充的關(guān)系。,細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化和去糖基化分別由O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和O-GlcNAc 糖苷酶催化。蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾及其生物學(xué)意義目前成了蛋白質(zhì)翻譯后修飾領(lǐng)域最熱門的課題之一。其研究目的：用原核和真核細胞表達OGT，并用不同的方法從這兩個系統(tǒng)提純重組OGT，獲得制備有活性的OGT，用于進行O-GlcNAc糖基酶功能方面的研究。,研究結(jié)果,用大腸桿菌和

19、Hi5 昆蟲細胞表達并純化具有活性的重組OGT。攜帶人OGTcDNA的PET 32a 質(zhì)粒在大腸桿菌中表達出帶有1個S-Tag 的重組人OGT 融合蛋白，然后用與S-蛋白質(zhì)偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠顆粒從細菌裂解液中親和層析純化得到OGT 融合蛋白。其純化的OGT在電泳中顯現(xiàn)單一條帶并具有生物活性，但其活性在洗脫后喪失。,IPTG 誘導(dǎo)重組OGT 在BL 21 大腸桿菌中的表達,大腸桿菌中表達的重組OGT 經(jīng)S-蛋白質(zhì)凝膠純化,研究結(jié)果,在H

20、i5 昆蟲細胞中表達的鼠肝OGT，經(jīng)鎳離子螯合柱純化后, 其比活性達到0.88 nmol·min-1·mg-1OGT。,Hi5 細胞中表達的重組OGT 的純化,甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及序列分析,利用與植物次生代謝產(chǎn)物糖基化相關(guān)的UDPG糖基轉(zhuǎn)移酶的特征性保守區(qū)域，設(shè)計了同源引物。以甜菊基因組DNA 為模板，PCR 擴增獲得甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段。根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計引物GSTr 和GSTf ，分別與cDNA文

21、庫的T3 和T7 通用引物擴增獲得全長核苷酸序列的甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因。,The level of expression of plant glycosyltransferases,Transgenic pigs with GnT-III,Recombinant plant glycosyltransferases reported recently (2001–2004),葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實驗研究,葡糖基轉(zhuǎn)移酶是致

22、齲菌的重要致病因素之一， 具有利用蔗糖合成細胞外葡聚糖的催化活性和結(jié)合葡聚糖的活性，在細菌附著和菌斑形成的過程中起著重要作用。抑制GTF活性，減少葡聚糖的產(chǎn)生是控制菌震斑預(yù)防齲病的重要手段之一。目的： 動物體內(nèi)研究葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS 免疫原性和防齲效果。,葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實驗研究,方法： 構(gòu)建大鼠人工齲模型，分別用人工抗原HDS-KLH，多肽抗原HDS，葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)免疫大鼠，酶聯(lián)免疫吸

23、附法檢測大鼠血清和唾液中抗HDS、GTF抗體；體視顯微鏡下觀察各組大鼠磨牙齲壞情況，并用Keyes計分法計分。,葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實驗研究,結(jié)果：HDS-KLH免疫組大鼠唾液、血清中抗HDS IgG和IgA 水平均高于對照組(P <0.05)；HDS-KLH，HDS，GTF免疫組大鼠齲Keyes 計分均低于對照組( P < 0101)，光滑面防齲效果最為顯著。結(jié)論：人工抗原 HDS-KLH 能刺激機

24、體產(chǎn)生針對GTF 的保護性免疫，并減少實驗大鼠齲齒發(fā)生。,葡糖基轉(zhuǎn)移酶抗體的制備與研究,以葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫產(chǎn)蛋母雞。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定雞蛋黃中免疫球蛋白的活性。經(jīng)葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫后可以得到高效價的蛋黃抗體，其抗遠援鏈球菌的效價約為一般IgY的16倍。 體外模擬實驗表明經(jīng)遠援鏈球菌免疫的蛋黃抗體確實有抗牙菌斑形成的能力，從而具備防齲齒的功效。,第二節(jié) 糖苷酶,糖苷酶(G1ycosidase)是一大類催化糖苷鍵水解的酶類。其

25、主要分布在動物、植物、微生物體內(nèi)，擔(dān)負著水解各種糖苷、寡糖、多糖、復(fù)雜多糖以供機體利用的生物學(xué)功能。大多數(shù)糖苷酶水解典型O-糖苷鍵，也有部分水解N-糖苷鍵，有一些糖苷酶水解S-糖苷鍵。,一、糖苷酶的分類,按照酶的作用方式和水解產(chǎn)物可把糖苷酶分為兩大類：外切糖苷酶類（Exoglycosidases)： 它們的作用方式是從糖鏈的非還原端開始，逐步將糖苷鍵切斷，所得到的水解產(chǎn)物為單糖或雙糖；內(nèi)切糖苷酶類（Endoglycosid

26、ases)： 它們從糖鏈的中間打斷糖苷鍵，水解產(chǎn)物為分子量小于原來底物的寡糖。,Exo-1-4-Beta-D-Glycanase,二、糖苷酶的分布,糖苷酶在自然界有廣泛分布，幾乎所有動物、植物和微生物體內(nèi)都能找到糖苷鍵。在哺乳動物中，血清、血細胞、體液、各種組織器官中都有存在。許多軟體動物也是糖苷酶的良好來源。植物種子里有豐富的糖苷酶。一些細菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相當(dāng)?shù)难芯繄蟮馈?三、糖苷酶的命名,糖苷酶的命名與它的

27、底物專一性密切相關(guān)。底物專一性包含：糖基一側(cè)的專一性；糖苷鍵的?-?-異頭專一性；糖苷配基一側(cè)的專一性。糖苷酶的命名是根據(jù)糖基一側(cè)的專一性和糖苷鍵的?-?-異頭專一性來命名的。?-葡萄糖苷酶、 ?-葡萄糖苷酶、 ?-半乳糖苷酶、 ?-甘露糖苷酶等。,(1)糖基一側(cè)的專一性(2)糖苷鍵的?-?-異頭專一性(3)糖基配基一側(cè)的專一性,四、糖苷酶的生物學(xué)功能,(1)分泌到細胞外的糖苷酶，參與營養(yǎng)物質(zhì)的胞外消化吸收過程。(2)

28、細胞內(nèi)的糖苷酶，如動物細胞內(nèi)的溶酶體中有一系列糖苷酶，它們的功能是降解胞內(nèi)的糖復(fù)合物。(3)參與糖鏈的合成，如在糖蛋白生物合成過程中，參加N-型糖鏈的“剪枝”， “修剪”成較短分支(Man3GlcNAc-Asn)結(jié)構(gòu)，然后再由糖基轉(zhuǎn)移酶加上新的糖基，形成不同結(jié)構(gòu)的糖鏈。,Biological Roles of N-glycanase in Cells,五、一些常見的糖苷酶,?-D-甘露糖苷酶　?-D-甘露糖苷酶?- D-木糖苷酶

29、?,?-鼠李糖苷酶? -D-葡萄糖苷酶?-D-葡萄糖苷酶： 海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麥芽糖酶。 　唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶類)。,一些常見的糖苷酶,?-D-半乳糖苷酶? -D-半乳糖苷酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-N-乙酰己糖胺酶　 ? -D-N-乙酰葡糖胺酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-巖澡塘苷酶 ?-L-巖澡塘苷酶,水解不同類型糖苷鍵的糖苷酶,六、糖苷酶的制備方法,黃芪皂苷糖

30、苷酶產(chǎn)生菌的篩選將篩選用菌株Absida sp. A9r 、A84r 、A9r 、A8r 、A38r 、Arr進行培養(yǎng)制備酶液 ? 以黃芪總皂苷為底物進行誘導(dǎo) ? 薄層層析法檢測水解結(jié)果。結(jié)果：A bsida sp. A3r 菌所產(chǎn)酶液能較好的水解黃芪總皂苷中糖基較多的皂苷，進而生成糖基較少的皂苷。,綠色木霉產(chǎn)生的外切β-葡聚糖苷酶從潮濕的樹皮及腐爛的木塊上采集樣本? 加適量的無菌水溫和攪拌?取1 ml 懸濁液,分別涂于含有濾紙的

31、固體篩選培養(yǎng)基上?待長出若干菌落后，對生長良好的菌種進行分離?以羧甲基纖維素鈉為底物分別測定其所產(chǎn)酶活性。菌培養(yǎng)液過濾?上清液硫酸銨沉淀?　Sephadex 柱層析?DEAE2纖維素52 陰離子交換柱層析?收集洗脫純酶液。,一株神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖苷酶產(chǎn)生菌的分離采用神經(jīng)節(jié)苷脂選擇性培養(yǎng)基，從土壤微生物中篩選得到一株產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖苷酶的菌株YW2112，該酶能特異性水解神經(jīng)節(jié)苷脂中連接神經(jīng)酰胺和寡糖鏈之間的糖苷鍵，是研究神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)

32、構(gòu)與功能的重要工具酶。,人參糖苷酶提取目的： 用于對人參皂苷進行改造的糖苷酶。方法： 從鮮人參根中提取人參皂苷酶，乙醇沉淀，離子交換層析純化，凝膠電泳分析，薄層色譜法測酶活力。結(jié)果： 經(jīng)離子交換層析得到人參皂苷?-葡糖苷酶。,七、糖苷酶的分離、純化和測定,糖苷酶的分離純化，在原則和技術(shù)方法上和一般的蛋白質(zhì)或酶的分離純化沒有區(qū)別。常用的方法： 鹽析(硫酸銨沉淀)、柱層析(離子交換、凝膠過濾、親和層析、吸附)，

33、電泳等。,一些糖苷酶的分離純化方法,親和層析法分離純化糖苷酶,糖苷酶活性測定,糖苷酶活性測定：(1)最常用的方法是以合成的對硝基苯酚糖苷化合物作為底物，在酶作用下釋放出的對硝基苯酚，在堿性條件下呈黃色，可用分光光度計法定量測定。(2)把傘形酮類螢光化合物(4-Methyumbelliferone)結(jié)合到神經(jīng)氨酸的半縮醛羥基上，生成4-甲基傘形酮基N-乙酰神經(jīng)氨酸苷，用做神經(jīng)氨酸苷酸的底物。在酶作用下，釋放出發(fā)螢光的4-甲基傘形酮，用

34、360nm波長光作激發(fā)光，在440nm波長處測發(fā)射光，可定量地測定釋放的4-甲基傘形圈。,糖苷酶活性測定,(3)需要以合成的或天然的雙糖、寡糖、糖肽甚至糖脂作為底物的方法。有兩種情況：一是測定糖苷酶作用下從非還原端釋放的單糖。用雙糖?-O-2-L-吡喃巖藻糖基-D-半乳糖為底物。釋放出來的巖藻糖，可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿谆杳蜒苌铮瑲庀嗌V上測定。,糖苷酶活性測定,二是在酶作用下，非還原端的糖基釋放后，測定其余下的部分。采用螢光化合物(?

35、-氨基吡啶, 5-二甲氨基萘磺?；?標記在底物糖鏈的還原末端，結(jié)合使用高效液相色譜分離，用螢光分光光度計檢測酶活性。,八、糖苷酶的應(yīng)用,在糖鏈結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用作為工具酶的糖苷酶? -D-半乳糖苷酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-N-乙酰己糖胺酶　 ? -D-N-乙酰葡糖胺酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-巖澡塘苷酶 ?-L-巖澡塘苷酶,1、作為工具酶的糖苷酶,糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖復(fù)合物在生物體內(nèi)，尤其是在

36、細胞表面攜帶著生物的信息，在分子識別過程中起著重要作用。研究其功能，首先要研究其結(jié)構(gòu)。闡明一種糖復(fù)合物的糖鏈結(jié)構(gòu)往往需要綜合運用多種技術(shù)方法包括過碘酸氧化、甲基化反應(yīng)、紅外光譜、核磁共振以及糖苷酶作用等。糖苷酶的使用在糖鏈結(jié)構(gòu)研究主要體現(xiàn)在以下幾個方面：,(1)外切糖苷酶的作用特點和底物專一性,通過糖苷酶水解，能切下非還原末端的一個單糖，同時提供關(guān)于糖基的組成、排列順序以及糖苷鍵的?-或?-異頭構(gòu)型的信息。糖基組成，用糖鏈完全酸

37、水解，加上紙色譜或氣相色譜分析得到的結(jié)果，可以和應(yīng)用糖苷酶所得到的結(jié)果相印證。,外切糖苷酶的作用特點和底物專一性,糖鏈中糖基的連接順序分析，甲基化反應(yīng)過碘酸氧化和核磁共振等方法，結(jié)合糖苷酶的逐步水解方法，可提供順序的信息。采用核磁共振和紅外光譜法分析糖苷鍵的?-或?-異頭構(gòu)型。在不具備這些大型儀器的條件下，可采用糖苷酶水解的。,(2)打開糖肽鍵獲得完整糖鏈,打開O-型糖肽鍵常用的方法是采用稀堿水解(?-消除反應(yīng))的方法。打開N-型糖

38、肽鍵主要采用肼解法?？刹捎锰擒彰阜椒ù蜷_糖肽鍵，獲得天然的完整糖鏈。?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶H(Endo-H)的應(yīng)用，在多甘露糖型N-型糖鏈的研究中，收到良好效果。,(3)獲得短糖鏈,有些植物或微生物來源的糖鏈，分子量大，并有重復(fù)的寡糖結(jié)構(gòu)單位，可以應(yīng)用合適的內(nèi)切糖苷酶，將長的糖鏈打斷成為較短的寡糖片段，有利于結(jié)構(gòu)研究。,2、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖苷酶,從肺炎雙球菌的培養(yǎng)液中純化得到?-半乳糖苷酶，可以水解Gal-?-1,4Glc

39、NAc糖苷鍵，但不能水解?-1,3和?-1,6鍵，表現(xiàn)出嚴格的對取代位置的專一性要求。?-半乳糖苷酶常用于N-型糖鏈的結(jié)構(gòu)分析，因為在N-型糖鏈中，Gal-G1cNAc之間的連鍵多為?-1,4。,用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖苷酶,?-半乳糖苷酶?-半乳糖苷酶?-甘露糖苷酶?-甘露糖苷酶?-巖藻糖苷酶?-N-乙酰己糖胺酶?-N-乙酰半乳糖胺酶唾液酸苷酶,?-半乳糖苷酶的底物專一性,?-巖藻糖苷酶的底物專一性,唾液酸苷酶的底物專

40、一性,?-半乳糖苷酶的底物專一性,3、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖苷酶,內(nèi)切糖苷酶主要體現(xiàn)在對糖基一側(cè)整個寡糖鏈的結(jié)構(gòu)有專一要求。它們作用于糖鏈的中間打斷糖苷鍵，水解產(chǎn)物為分子量小于原來底物的寡糖。,用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖苷酶,?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶?-N-乙酰半乳糖胺內(nèi)切酶?-半乳糖苷內(nèi)切酶?-1,6甘露聚糖內(nèi)切酶?-1,4氨基半乳糖苷內(nèi)切酶,幾種內(nèi)切糖苷酶的底物專一性,(1) ?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶,按其來源和底物專一性

41、的差別，共分四種。(1)它們都能水解N-型糖中緊挨著天冬酰胺的兩個N-乙酰葡糖胺之間的?-1,4連接鍵。,(2)Endo-D和Endo-C1的底物專一性完全相同。 都要求在糖基一側(cè)有一個三碳結(jié)構(gòu)。非還原末端的?-甘露糖殘基必需沒有被其他糖取代。,?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶,(3)indo-H的底物專一性，在糖基一例要求一個四糖結(jié)構(gòu): 非還原末端的?-甘露糖必需是，或者不被取代、或者是僅僅取代在C-2位置上。,卵清蛋白糖肽

42、的一條糖鏈,?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶,(4)Endo-C11的底物專一性，在糖基一側(cè)要求一個分枝的五糖單位，并且兩個處于還原末端的?-甘露糖殘基都必需、或者不被別的糖基取代，或者僅取代在C-2位置上。Endo-C11在糖苷配基一側(cè)的專一性要求，和Endo-H一樣，不容許有巖藻糖的取代。,(2) ?-N-乙酰半乳糖苷內(nèi)切酶,蛋白的O-型糖鏈中最常見的一種，是由糖鏈還原末端的N-乙酰半乳糖胺和糖鏈中的絲氨酸或蘇氨酸的羥基以?-0-糖苷鍵連

43、接而成。?-N-乙酰半乳糖胺內(nèi)切酶能夠切開這個連鍵，把0-型糖鏈和肽鏈完全分開。,(3) ? -半乳糖苷內(nèi)切酶,糖基一側(cè)必須是一個三糖單位，失去非還原末端的半乳糖-乙酰半乳糖胺，都不能成為該酶的底物。糖苷配基一側(cè)必須是N-乙酰葡糖胺或葡萄糖。被酶水解打開的糖苷鍵必須是?-1,4連接。這個內(nèi)切酶只能用于帶有血型A(或B)決定簇的糖鏈，能作用于血型物質(zhì)H。,(4) 其他內(nèi)切糖苷酶,來自灰色鏈霉菌發(fā)酵液的一個氨基半乳糖苷內(nèi)切酶，可以水解

44、?-氨基半乳糖苷鍵。用于一種真菌所產(chǎn)生的氨基半乳聚糖的結(jié)構(gòu)研究。來自一株土壤芽孢桿菌的?-1,6甘露聚糖酶，能水解無側(cè)鏈取代的?-1,6甘露糖糖苷鍵，在研究酵母胞壁外層甘露聚糖結(jié)構(gòu)時，將大分子甘露聚糖外側(cè)鏈打斷，獲得靠近天冬酰胺結(jié)合位置的內(nèi)核結(jié)構(gòu)。,4、應(yīng)用中的問題,在應(yīng)用糖苷酶進行糖鏈結(jié)構(gòu)研究時，所取得的實驗結(jié)果，應(yīng)對照其他技術(shù)方法提供的信息，小心加以解釋，以免引出錯誤的結(jié)論。影響糖苷酶測定結(jié)果的因素很多，大致有以下幾個方面：,(

45、1) 工具酶的選擇,任何一助糖苷酶都可用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的工具酶。一般應(yīng)選擇文獻中常用的，底物專一性清楚的糖苷酶作為工具酶。一種新分離純化的糖苷酶，應(yīng)該用各種常見的糖苷鍵結(jié)構(gòu)類型作底物，做一系列酶活性測定，確定其底物專一性，然后才能用做工具酶。,(2) 工具酶的純度,所采用的工具酶不應(yīng)混雜有別的酶。如果有少量蛋白酶沒有除盡，則可能在酶反應(yīng)中將所用的工具酶水解掉，使糖鏈水解過程中斷，并使產(chǎn)物中混入不應(yīng)有的雜質(zhì)，結(jié)果分析帶來困難。如果

46、有少量別種的糖敢酶摻雜在工具酶中，有可能帶來錯誤的實驗結(jié)果。,(3) 遮蔽效應(yīng),按照其他技術(shù)方法得到的信息，選擇了一個合適的糖苷酶，可得不到預(yù)期的結(jié)果?？赡苁穷A(yù)先得到的信息有錯誤?？赡苁橇硪粋€原因，底物結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，造成了分子的空間遮蔽效應(yīng)。,(4) 其他方面,在應(yīng)用糖苷酶于糖鏈結(jié)構(gòu)分析，遇到意料之外的負結(jié)果時，應(yīng)考慮以下幾種情況。(1)底物是否充分溶解了?有的樣品在水溶液中溶解不好，尤其是糖脂和膜結(jié)合糖蛋會極大地影響糖苷酶的水

47、解效果。適當(dāng)?shù)丶尤肴ノ奂】稍鰪娞俏裘笇μ侵乃狻?其他方面,(2)是否有抑制劑存在?在復(fù)雜的無細胞制劑系統(tǒng)中，抑制劑存在的可能性更大。要考慮底物抑制或單糖抑制的可能性。(3)是否遇到了不常見的呋喃糖環(huán)?因為絕大多數(shù)工具糖苷酶，是專一于吡喃環(huán)形式的。,?-L-巖藻糖苷酶測定的臨床應(yīng)用,?-L-巖藻糖苷酶是一種溶酶體酸性水解酶。以往主要用于遺傳性AFU缺乏引起的巖藻糖貯積病的診斷。近年來發(fā)現(xiàn)，?-L-巖藻糖苷酶測定對肝癌的診

48、斷具有較高的敏感性和特異性。動態(tài)監(jiān)測有利于肝癌的早期診斷、鑒別診斷, 并可作為轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的指標，也可用于白血病及卵巢癌的診斷。,,葡萄糖苷酶可以使白葡萄酒的香氣提高,葡萄酒的香氣和味道是受聯(lián)結(jié)在一起的非易失性的化合物影響的，它可以被葡萄糖苷酶所損壞。,內(nèi)切木聚糖酶與木糖苷酶預(yù)處理對麥草漿漂白性能的影響,結(jié)果表明，無論是內(nèi)切木聚糖酶還是木糖苷酶預(yù)處理漂白漿的白度均比對照漿高，分別高出對照漿的2. 5 和1. 9 個百分點，同時漂白漿的

49、強度也好于對照漿的強度。內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶混合預(yù)處理漂白漿的白度分別比內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶高出0. 9 和1. 5 個百分點，這表明內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶在紙漿預(yù)處理過程中具有協(xié)同作用。,血漿殼三糖苷酶活性與冠狀動脈病變密切相關(guān),對126例冠狀動脈造影術(shù)患者按冠狀動脈狹窄程度分組，將狹窄程度< 50%者列為對照組，≥50%者列為病變組，比較各組血清殼三糖苷酶及血脂等指標，進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病變組血清殼三糖苷酶水平