納米銀對土壤氮素微生物轉(zhuǎn)化過程的影響及其機(jī)制.pdf

1、納米銀(AgNPs)是應(yīng)用最廣泛的商品化納米材料之一，近年來消費(fèi)品中含有AgNPs的數(shù)量和比例增加，隨AgNPs生產(chǎn)制造、使用及廢棄的過程使其不可避免的進(jìn)入陸生系統(tǒng)之中。AgNPs擁有良好的長效廣譜抗菌作用，對多種微生物具有強(qiáng)烈抑制作用。土壤氮素轉(zhuǎn)化過程主要由土壤微生物介導(dǎo)，當(dāng)AgNPs進(jìn)入土壤環(huán)境后對土壤微生物的活性造成損傷。AgNPs作為新型污染物質(zhì)進(jìn)入農(nóng)田環(huán)境中，對土壤微生物、作物氮素利用均會造成一定程度的影響，其中由硝化細(xì)菌所介

2、導(dǎo)的土壤硝化反應(yīng)對AgNPs均有高度敏感性。研究調(diào)查AgNPs在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化、化學(xué)特性及毒理作用是監(jiān)控及治理新型土壤污染物的必要手段，探討AgNPs對土壤微生物的抑制機(jī)理以及對氮素轉(zhuǎn)化微生物和相關(guān)功能基因表達(dá)量的影響，對治理和緩解釋放到土壤環(huán)境中的AgNPs所產(chǎn)生的危害提出具體的指導(dǎo)方向。
　　本研究在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，采用批量處理實(shí)驗(yàn)方法探討AgNPs暴露對土壤微生物多樣性、土壤氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵微生物過程、AgNPs對土壤微生物

3、抑制機(jī)理以及AgNPs對土壤氮初級轉(zhuǎn)化速率的影響進(jìn)行研究。通過實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下基于Illumina測序平臺研究了暴露在AgNPs環(huán)境中對土壤微生物多樣性的影響;探究土壤AgNPs對土壤氨化、硝化作用強(qiáng)度的影響，并采用實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction Detecting System，QPCR)擴(kuò)增儀測定AgNPs對土壤氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵功能基因拷貝數(shù)的影響;研究A

4、gNPs對土壤氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵微生物活性的抑制機(jī)理，采用氨氧化細(xì)菌模式菌株歐洲亞硝化毛桿菌Nitrosomonas europeae作為研究對照，比較不同劑量、尺寸及釋放Ag+對N.europeae活性的影響;基于15N同位素稀釋技術(shù)研究在AgNPs對土壤氮初級硝化速率、土壤氮初級礦化速率的影響，并測定AgNPs對土壤無機(jī)氮肥及有機(jī)氮肥轉(zhuǎn)化、酶活性的影響。本文為AgNPs新型污染物所導(dǎo)致的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變、土壤氮循環(huán)的影響及肥料利用

5、提出量化分析結(jié)果的參考。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的方式將土壤分別暴露在AgNPs含量為10、50、100mg/kg的環(huán)境中28℃培養(yǎng)7d，采用氯仿熏蒸及土壤誘導(dǎo)呼吸的方式測定AgNPs對土壤微生物生物量氮和活性的影響，并通過提取土壤細(xì)菌總DNA采用Illumina測序平臺對V4區(qū)域進(jìn)行土壤微生物群落多樣性分析。研究結(jié)果表明，土壤暴露在AgNPs環(huán)境中抑制土壤微生物的活性，當(dāng)AgNPs含量分別為10、50、1

6、00mg/kg時(shí)，空白對照組土壤微生物生物量氮含量分別高于AgNPs處理組33.0％、58.7％、71.1％;空白對照組誘導(dǎo)呼吸量高于AgNPs處理組1.17％、17％、29.3％，即低劑量AgNPs暴露條件下對土壤誘導(dǎo)呼吸量抑制不顯著。土壤微生物多樣性研究結(jié)果分析表明，在屬分類水平土壤AgNPs暴露劑量和所檢測出細(xì)菌類群的種類呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但優(yōu)勢門類檢測數(shù)量基本一致。不同劑量AgNPs暴露下對土壤微生物主導(dǎo)菌群門類（變形菌門Proteo

7、bacteria、酸桿菌門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteria）不產(chǎn)生顯著作用，變形菌門群落豐度百分比與土壤AgNPs含量呈正相關(guān)，酸桿菌門、放線菌門的群落豐度百分比與AgNPs含量呈負(fù)相關(guān)。高劑量AgNPs暴露下土壤微生物群落中的α-、β-、γ-、δ-變形菌綱豐度在細(xì)菌綱水平豐度高于對照組。酸桿菌綱發(fā)育分類下的目、科、屬在各分類水平群落豐度百分比均屬于絕對優(yōu)勢豐度菌群，且各發(fā)育水平下的群落豐度百分比和土壤A

8、gNPs劑量呈負(fù)相關(guān)。
　　2.實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下研究AgNPs對土壤硝化作用強(qiáng)度，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)測定AgNPs對土壤硝化功能基因amoA、Arch-amoA基因拷貝數(shù)的影響;利用氨氧化細(xì)菌模式菌株歐洲亞硝化毛桿菌Nitrosomonas europeae研究AgNPs對土壤硝化細(xì)菌活性抑制的機(jī)理，將N.europeae接種到含有不同劑量、尺寸AgNPs的培養(yǎng)基中探究對細(xì)菌抑制程度的影響。
　　研究結(jié)果表

9、明，土壤暴露在AgNPs環(huán)境中對土壤硝化作用產(chǎn)生抑制，土壤硝化反應(yīng)的抑制程度和AgNPs暴露劑量呈正相關(guān)，其中土壤AgNPs含量分別為50mg/kg和100mg/kg時(shí)AgNPs對該暴露劑量下的土壤硝化作用抑制率組間差異不顯著。土壤AgNPs暴露劑量分別為10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg時(shí)，AgNPs對土壤微生物硝化功能基因amoA基因表達(dá)量的抑制率分別為34.4％、68.8％和91.8％，即土壤AgNPs含量100mg

10、/kg時(shí)對硝化作用抑制率極顯著。N.europeae接種到含AgNPs(50nm)的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)其亞抑制作用的濃度范圍為5-10mg/L，且在此濃度范圍培養(yǎng)5-8h時(shí)AgNPs對細(xì)菌所產(chǎn)生抑制率下降，即在此培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)N.europeae細(xì)胞活性緩慢恢復(fù);當(dāng)N.europeae暴露在AgNPs劑量為20mg/L的培養(yǎng)基中時(shí)對細(xì)菌活性抑制率高達(dá)77％，且抑制率不隨培養(yǎng)時(shí)間變化。采用流式細(xì)胞(FCM)技術(shù)測定不同劑量、粒徑AgNPs對N.e

11、uropeae細(xì)胞致死率的影響，結(jié)果表明AgNPs(50nm)所釋放出的Ag+導(dǎo)致細(xì)胞壞死率占該劑量AgNPs所引起細(xì)胞壞死率的45％;通過透射電鏡-能譜儀(TEM-EDS)檢測發(fā)現(xiàn)AgNPs粒子可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密吸附結(jié)合造成細(xì)胞損傷;在同劑量下AgNPs粒子的尺寸越小，導(dǎo)致的細(xì)胞壞死率越高，小粒徑AgNPs在低劑量時(shí)能顯著影響細(xì)胞壞死率。
　　3.通過稀釋平板計(jì)數(shù)法測定AgNPs暴露下土壤可培養(yǎng)氨化細(xì)菌、反

12、硝化細(xì)菌的數(shù)量，并測定AgNPs對蛋白酶活性、土壤反硝化功能基因nosZ基因拷貝數(shù)的影響;將反硝化模式菌株反硝化無色桿菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞單菌Pseudomonas stutzeri分別接種到含AgNPs的培養(yǎng)基中，探究AgNPs對反硝化細(xì)菌的影響。研究結(jié)果表明，暴露在AgNPs環(huán)境中的土壤可培養(yǎng)氨化細(xì)菌數(shù)量及蛋白酶活性均受到抑制，可培養(yǎng)氨化細(xì)菌數(shù)量及酶活性抑制程度與土壤AgNPs暴露劑量呈

13、正相關(guān)。AgNPs對土壤可培養(yǎng)反硝化細(xì)菌數(shù)量、nosZ基因拷貝數(shù)均未產(chǎn)生顯著抑制作用，即土壤反硝化細(xì)菌對AgNPs具有強(qiáng)烈的抗性。反硝化無色桿菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞單菌Pseudomonas stutzeri分別接種到含AgNPs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，當(dāng)培養(yǎng)基中AgNPs劑量為5mg/L時(shí)通過掃描電鏡(SEM)觀察到兩種菌體表面均形成緊密的莢膜，且此劑量下對細(xì)菌生長無抑制作用;當(dāng)培養(yǎng)基中AgN

14、Ps劑量為20mg/L時(shí)，兩種菌體表面形成緊致的莢膜層，且通過透射電鏡(TEM)觀察到Achromobacter denitrificans的細(xì)胞膜完整，對細(xì)菌生長抑制不顯著。
　　4.實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下批量實(shí)驗(yàn)處理，測定AgNPs劑量分別為10、50、100mg/kg時(shí)土壤硝酸還原酶、亞硝酸還原酶隨時(shí)間酶活性的變化;通過施加無機(jī)氮肥CO(NH2)2、(NH4)2SO4、KNO3探究AgNPs對土壤氮素轉(zhuǎn)化酶活性的影響;在AgNP

15、s暴露下的土壤分別施加秸稈和豬糞，探究AgNPs對土壤有機(jī)氮肥轉(zhuǎn)化的影響;基于i5N稀釋技術(shù)測定不同劑量AgNPs暴露下對土壤氮初級硝化速率及礦化速率的影響。
　　研究結(jié)果表明，當(dāng)土壤暴露在AgNPs的培養(yǎng)條件下時(shí)，硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性與土壤AgNPs暴露劑量呈負(fù)相關(guān)。土壤AgNPs含量為10mg/kg時(shí)，硝酸還原酶活性未受抑制;當(dāng)土壤AgNPs含量100mg/kg時(shí)，硝酸還原酶活性抑制顯著。土壤AgNPs暴露劑量為50m

16、g/kg和100mg/kg時(shí)，硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性與對照組相比抑制顯著，但處理組間抑制程度相當(dāng)。通過施加無機(jī)氮肥CO(NH2)2、(NH4)2SO4可促進(jìn)暴露在AgNPs環(huán)境中土壤脲酶的活性，其酶活性依舊受到AgNPs的抑制作用;暴露于AgNPs環(huán)境中的土壤施加KNO3、CO(NH2)2對硝酸還原酶均有一定促進(jìn)作用;施加CO(NH2)2及(NH4)2SO4在未添加AgNPs及低劑量AgNPs(10mg/kg)處理土壤中，對亞硝酸

17、還原酶活性無顯著促進(jìn)作用;AgNPs暴露條件下的土壤，施加KNO3促進(jìn)羥胺還原酶活性。在土壤AgNPs暴露劑量為100mg/kg的條件下分別施加秸稈和豬糞，暴露在AgNPs環(huán)境下的土壤NH4+-N、NO3--N含量均低于分別僅施加秸稈和豬糞的處理組土壤，即AgNPs抑制土壤分解細(xì)菌的活性，使得有機(jī)氮肥施加后不易被分解成無機(jī)氮。
　　在培養(yǎng)初期2h-3d時(shí)，土壤氮初級硝化速率及土壤氮初級礦化速率和AgNPs暴露劑量呈負(fù)相關(guān);培養(yǎng)后期

18、的部分培養(yǎng)時(shí)間段AgNPs處理組轉(zhuǎn)化速率略高于對照組。在2h-1d培養(yǎng)時(shí)間段，土壤空白對照組的氮初級礦化速率分別高于土壤AgNPs含量為10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg的9.3％、22.63％和34％，氮初級礦化速率分別高于24.1％、62.3％和82.2％。在AgNPs暴露下的土壤施加NH4NO3，土壤中NO3--N含量與AgNPs劑量呈負(fù)相關(guān)，表明AgNPs劑量和土壤硝化作用抑制率呈正相關(guān)。施加NH4NO3使對照組及