三細(xì)胞骨架標(biāo)本的制備及觀察

1、實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞骨架標(biāo)本的制備及觀察,,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 掌握細(xì)胞骨架的顯示方法的原理。2．熟悉光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。3. 了解細(xì)胞骨架標(biāo)本的制備方法。,二、實(shí)驗(yàn)材料,洋蔥鱗莖、光學(xué)顯微鏡、水浴箱、載玻片、蓋玻片、吸管、培養(yǎng)皿、青霉素小瓶、鑷子、剪子、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、pH7.2 PBS（無鈣鎂磷酸緩沖液）、pH6.5 PBS、M-緩沖液（10×原液）、1% TritonX-100、

2、2%TritonX-100、3%戊二醛液、0.2%考馬斯亮蘭染液。,三、實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞內(nèi)由蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚，是一種非離子去垢劑）處理細(xì)胞時(shí)，可將質(zhì)膜中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)溶解，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻不被破壞，經(jīng)固定和考馬斯亮蘭（非特異性蛋白質(zhì)染料）染色后，可使細(xì)胞骨架蛋白著色而顯示骨架顯微結(jié)構(gòu)。由于骨架系統(tǒng)中有些纖維（如微管）在該實(shí)驗(yàn)條件下不夠穩(wěn)定，而有些類

3、型的纖維太細(xì)，在光鏡下無法分辨，因此顯示看到的主要是微絲組成的微絲束。采用活體染色等方法制備細(xì)胞骨架標(biāo)本，加強(qiáng)動(dòng)手能力和了解臨時(shí)制片的方法。,四、實(shí)驗(yàn)方法,1. 洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞細(xì)胞骨架標(biāo)本制備（1） 撕取約5×5mm大小的洋蔥鱗莖中層鱗片的內(nèi)表皮，浸入pH6.5 PBS中5min后，再放入盛有2%TritonX-100液的小瓶中，37℃處理20～30min，以溶解掉細(xì)胞骨架以外的蛋白質(zhì)。 （2）用吸管吸盡2%T

4、ritonX-100液，加入M-緩沖液洗滌2～3次，每次5min，以使細(xì)胞骨架穩(wěn)定。,四、實(shí)驗(yàn)方法,（3）吸棄M-緩沖液，加人3%戊二醛固定液，固定10min，再用PBS洗2～3次，每次3min。 （4）吸盡緩沖液，加0.2%考馬斯亮蘭染液，染色8～10min，再用PBS洗2～3次，每次3min。（5）取出洋蔥鱗莖表皮，平展于載玻片上，蓋上蓋玻片即可觀察。,五、結(jié)果與分析,光鏡下可見洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞的胞質(zhì)著色極淡，其中被染成