沙雷氏菌耐受和還原六價(jià)鉻及其鉻還原酶NqoD的基因研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)中排放的重金屬因能在環(huán)境中長(zhǎng)期積累使其污染成為一個(gè)非常嚴(yán)重的環(huán)境問題。重金屬元素鉻(Cr)及鉻鹽廣泛應(yīng)用于冶金、電鍍、皮革、染料等行業(yè)，這些行業(yè)排放的含六價(jià)鉻[Cr(Ⅵ)]的廢水廢渣是環(huán)境中鉻污染的主要來源。微生物法處理環(huán)境Cr(VI)污染與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比具有經(jīng)濟(jì)、高效、效果好等許多優(yōu)點(diǎn)，因此，利用微生物法治理 Cr(VI)污染成為新時(shí)期國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。本研究擬從 Cr(VI)污染環(huán)境中篩選出耐鉻細(xì)菌，

2、研究該菌株耐受和還原 Cr(VI)的特性，并從菌株中分離純化出與 Cr(Ⅵ)還原相關(guān)的酶；通過研究鉻還原酶的基因序列和其編碼的蛋白質(zhì)及在大腸桿菌中表達(dá)后的特性，探索細(xì)菌耐受和還原 Cr(Ⅵ)的分子機(jī)制，為構(gòu)建高效除鉻工程菌提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、探討耐鉻菌株耐受和還原六價(jià)鉻的特性。從Cr(Ⅵ)污染環(huán)境中采集河水和底泥，經(jīng)逐步升高 Cr(Ⅵ)濃度的含鉻培養(yǎng)基篩選出高耐鉻菌株CQMUS2。與對(duì)

3、照菌大腸桿菌DH5α比較，CQMUS2的Cr(Ⅵ)耐受能力顯著高于對(duì)照菌(p<0.001)。CQMUS2在高Cr(Ⅵ)環(huán)境中生長(zhǎng)較低Cr(Ⅵ)環(huán)境減緩，Cr(Ⅵ)還原能力消失。在中性環(huán)境中CQMUS2生長(zhǎng)正常，Cr(Ⅵ)還原能力最強(qiáng)；在弱酸性環(huán)境中幾乎不生長(zhǎng)，還原Cr(Ⅵ)的能力最弱。在環(huán)境溫度高時(shí)還原 Cr(Ⅵ)的能力大；隨著環(huán)境溫度降低，菌株的生長(zhǎng)減緩、Cr(Ⅵ)還原能力降低。Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+能抑制CQMUS2

4、的生長(zhǎng)，酚和NH4+對(duì)生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。CQMUS2為革蘭氏陰性球菌或短桿菌，16srDNA鑒定結(jié)果表明其屬于沙雷氏菌屬。透射電鏡結(jié)果表明CQMUS2中Cr(Ⅵ)還原發(fā)生在細(xì)菌內(nèi)部，可初步確定具有Cr(Ⅵ)還原能力的物質(zhì)存在于細(xì)胞質(zhì)中，有分離出來的可能性。
　　2、CQMUS2中鉻還原酶的分離、純化和鑒定。探索細(xì)菌CQMUS2中總蛋白的提取條件，通過正交實(shí)驗(yàn)確定超聲破碎法提取蛋白質(zhì)的條件。確定硫酸銨百分飽和度為40-50％。通過比較

5、鉻還原酶在不同的pH緩沖液及離子強(qiáng)度條件下與陰離子交換劑的作用效果，選擇含0.2-0.7 mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.5)為離子交換層析洗脫液；離子交換層析結(jié)果顯示具有鉻還原能力的物質(zhì)有多種，以比活力最高者為進(jìn)一步研究對(duì)象。凝膠過濾層析后以比活力最高者為鉻還原酶，初步判斷該酶的相對(duì)分子質(zhì)量為50 kD左右。SDS-PAGE結(jié)果顯示分離純化后得到單一的鉻還原酶，且該酶由一條肽鏈構(gòu)成，其分子質(zhì)量約為50

6、kD。鉻還原酶經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)，通過MASCOT檢索出與其肽質(zhì)量指紋圖譜符合率最高的已知蛋白質(zhì)是NADH醌氧化還原酶亞基D(NqoD)。
　　3、鉻還原酶的酶學(xué)特性研究。鉻還原酶在分離純化過程中酶活力大增加，為粗酶液的940倍。酶反應(yīng)的最適pH為7.5，在近中性的環(huán)境中酶的活性和穩(wěn)定性都很好。酶活性隨著溫度的升高而增大，在70℃達(dá)到最大；酶的熱穩(wěn)定性在≤45℃時(shí)無明顯變化，然后隨著溫度升高而降低；酶反應(yīng)的最適溫度為5

7、0℃。酶的Km為2mg/L，反應(yīng)的最適底物濃度為20mg/L。加入NADH后酶活性大大地增加，為加入前的2.3倍，說明NADH確實(shí)是鉻還原酶的輔酶，能起到催化反應(yīng)的作用。
　　4、鉻還原酶 NqoD基因克隆和序列分析。在 BLAST檢索與CQMUS2的NqoD最相近的DNA堿基序列后，用primer premier5.0設(shè)計(jì)其PCR引物2對(duì)。確定PCR反應(yīng)條件，利用溫度梯度法確定反應(yīng)能夠進(jìn)行的退火溫度，利用正交實(shí)驗(yàn)探索較優(yōu)PCR體

8、系，結(jié)果表明僅引物2滿足研究需要。引物2的PCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序結(jié)果表明該片段全長(zhǎng)351bp，編碼116個(gè)氨基酸。該DNA序列與多種細(xì)菌的基因序列有80%以上的相似性；其氨基酸序列與多種微生物的NqoD、NuoD、NdhD等酶有70%以上的相似性，說明了此酶是廣泛存在的。
　　5、鉻還原酶 NqoD基因的表達(dá)研究。NqoD基因片段分別與pMD19-T克隆載體和pCold表達(dá)載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α中；用藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩

9、選重組陽性克隆；堿裂解法提取重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明重組克隆質(zhì)粒中確實(shí)存在著目的基因片段；重組表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，其Cr(Ⅵ)耐受和還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)后大腸桿菌對(duì)Cr(Ⅵ)的耐受比對(duì)照菌強(qiáng)，而對(duì) Cr(Ⅵ)的還原能力兩菌沒有顯著差異，說明目的基因得到了表達(dá)，但表達(dá)率先反映在對(duì) Cr(Ⅵ)的耐受能力上，還不足以還原Cr(Ⅵ)。
　　研究結(jié)論：耐鉻沙雷氏菌CQMUS2具有高度耐