庫特氏華癸菌漆酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、漆酶是一種酚氧化酶，屬于多銅氧化酶家族，4個(gè)Cu2+作為輔因子與酶的催化活性中心結(jié)合。漆酶的底物包括多種酚類和非酚類物質(zhì)，且催化氧化的過程中所需能量少，不額外產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物，故漆酶作為一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的綠色催化劑，廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、織物印染、紙漿漂白、生物能源、食品制造、生物傳感器、化學(xué)合成等諸多領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)研究了Kurthia huakuii漆酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其基本酶學(xué)性質(zhì)，并驗(yàn)證了其在染料脫色應(yīng)用中的可行性。
　　1

2、.將來源于Kurthia huakuii LAM0618的漆酶基因通過密碼子、GC含量及mRNA二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，克隆到基于pPIC9K改造的載體pPIC9K-NTS上。重組載體經(jīng)過單酶切線性化后電轉(zhuǎn)入Pichia pastoris GS115中，通過濃度梯度的遺傳霉素(G418)篩選獲得外源基因高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。然后通過誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并檢測酶活進(jìn)一步篩選得到一株高表達(dá)菌株。
　　2.在搖瓶水平優(yōu)化重組畢赤酵母的誘導(dǎo)條件，得出的結(jié)論

3、為:該重組菌在28℃下誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1.0％的Tween80，每12h添加誘導(dǎo)劑甲醇的量為發(fā)酵液體積的1.0％，表達(dá)產(chǎn)物的酶活性最高，72h酶活可達(dá)6877.24U/mL，遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)所提到的最高水平;
　　3.酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)表明，以10mmol/L2，6-DMP（2，6-二甲氧基苯酚）作為底物時(shí)最適反應(yīng)溫度65℃;酶的熱穩(wěn)定性較好，在90℃下保溫6h仍有70％以上的酶活;最適反應(yīng)pH=7.0，但pH適應(yīng)范圍較窄，pH＜

4、7.0或者pH＞8.0時(shí)酶活力迅速喪失;酶反應(yīng)最適Cu2+濃度0.04mmol/L;1 mmol/L EDTA就能完全抑制酶活力，3mmol/L PMSF使相對酶活降低到60％;1mmol/L Mn2+能促進(jìn)酶活。除此之外常見的金屬離子無論濃度高低，絕大多數(shù)都會(huì)抑制酶活力。
　　4.將誘導(dǎo)表達(dá)所得的粗酶液進(jìn)行染料脫色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在65℃下靜置反應(yīng)6h，該漆酶對的孔雀綠(10mg/L)和燦爛綠(10mg/L)效果較好，降解率分別可

5、達(dá)到86.50％和70.82％;對剛果紅(500mg/mL)、堿性品紅（50mg/mL）和亞甲基藍(lán)（10mg/mL）有脫色作用但不甚明顯，脫色率分別為13.95％、23.03％和6.95％;對結(jié)晶紫(10mg/mL)和堿性藏紅T（200mg/mL）則幾乎無脫色作用。
　　上述研究表明Kurthia huakuii LAM0618的漆酶在畢赤酵母中能得以高效表達(dá)，且未經(jīng)純化的粗酶液的酶活力可達(dá)到6877.24U/mL(65℃，pH=