核酸和蛋白質(zhì)技術(shù)

1、核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù),,第一節(jié) 核酸分析技術(shù),講述內(nèi)容： 1、核酸電泳 2、雜交技術(shù) 3、PCR技術(shù) 4、基因芯片,一、核 酸 電 泳,（一）DNA的凝膠電泳凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于200～1000bp的片段; 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離5－500bp的片段;

2、 效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對大量的DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析,瓊脂糖凝膠電泳的基本過程,材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴(kuò)散和用于電泳時(shí)間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。 基本過程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上

3、樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時(shí)間后停止電泳 取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果 注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套,,,,,,,不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍,,瓊脂糖濃度（％，W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（kb),,0.7

4、 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2

5、,,影響DNA在凝膠中遷移速率的因素：,1 DNA分子的大小2 構(gòu)象3 凝膠濃度4 電壓5 緩沖液,瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡過程中 DNA Ladder的形成,PCR產(chǎn)物的瓊脂 糖電泳,,聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析,特殊的凝膠電泳,倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE）：用于分離分子量10～2000kb的DNA分子；鉗位均勻電場電泳（CHEF電泳）：可分離大于107bp的DNA分子,基本過程同DNA電泳一樣，但

6、應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。,（二）RNA 電 泳,二 核酸雜交技術(shù),（一）Southern Blot原理：,將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖

7、凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。,Southern Blot 操作步驟：,DNA 瓊

8、脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色,,,,,,,原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。,（二）Northern Blot,操作過程,mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移

9、 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光,,,,,,（三）探針標(biāo)記技術(shù),1 標(biāo)記物：放射性和非放射性兩種放射性： 非放射性：生物素、地高辛素、熒光素 2、標(biāo)記方法 （1）切口平移法 （2）隨機(jī)引物法（3）末端標(biāo)記法（4）單鏈DNA探針標(biāo)記（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法,32P、35S和3H,三 PCR技術(shù),PCR (Polym

10、erase chain reaction) 是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。 Dr. Karry Mullis 1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；,目的: 用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。,（一）原理：雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈DNA －－－變性

11、 ↓與一對寡核苷酸引物（5’， 3’）降低溫度退火 DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為退火 ↓ 適溫延伸5’/3’引物形成新鏈變成4條鏈DNA －－延伸 ↓ 第二輪：變性—退火—延伸呈指數(shù)增長 理論值：一輪一

12、倍 10輪 103=1000倍 20輪 106 30 輪 109 理論 模板擴(kuò)增30輪 1ng-----------1g 實(shí)際 模板擴(kuò)增30輪 1ng-----------10?g,1 Taq DNA

13、聚合酶： 水生棲熱菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 ①5’?3’DNA聚合酶活性； ②無3’?5’外切酶活性， 35輪0.25%錯(cuò)配，與原始模板有差別； 最適聚合酶 溫度72℃，選擇72℃延伸 半衰期：92.5℃ 130min 95℃ 40min

14、 97.5℃ 5—6min 變性溫度：≤95℃使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性,（二）基本要素,pfu DNA 聚合酶,耐熱5’?3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精確度：pfu >Taq 但pfu擴(kuò)增效率通常比Taq酶略差文獻(xiàn)報(bào)道：Taq+pfu 會起到較好效果,2 .引物 人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

15、 Tm值要相近，每條10-50pmol /100?l ◆設(shè)計(jì)原則： （1）靠近5'上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同 3'下游Primer與雙鏈DNA正鏈互補(bǔ)，與負(fù)鏈相同 正鏈5'————— 3' ——上游Primer

16、 ——下游Primer 負(fù)鏈 3'————— 5' 例如： IL-3正鏈 5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3' 負(fù)鏈3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'

17、 上游~： 與其相同 下游~： 先寫出相應(yīng)負(fù)鏈3'→5'然后倒過來5'→3' 所以負(fù)鏈Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3',（2）Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列 形成loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu) 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意減少Prime

18、r間互補(bǔ)序列 導(dǎo)致2個(gè)Primer形成dimer 一般不要超過3個(gè)互補(bǔ)bp 如：CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA

19、 TCAGTAAGC,修飾 如：32P、生物素、熒光素，不影響其效果 突變： AGCTCCATGACCCAG 5'CGCTCCATGACCCAG 3' 注意：絕不可以在3'端進(jìn)行上述改造 ∵DN

20、A聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補(bǔ)→不能延伸,（4）Primer 5’未端可修飾、突變:,（5）primer 5’端增加堿基 ①內(nèi)切酶識別點(diǎn)： （G）GAATTC GCTCCATGACCCAG ↑保護(hù)bp

21、 對PCR產(chǎn)物cloning有很大好處 便于內(nèi)切酶消化，不同內(nèi)切酶需保護(hù)bP數(shù)量不同 EcoRI 1 BglII 2-3 XbaI 2-3 HindⅢ >3 BamHI 2-3 PstI >4 XhoI >4 NotI >10

22、 如果所用保護(hù)bp數(shù)量不合適→影響內(nèi)切酶消化→影響下步克隆 ∵未切開，連接不上,②ATG起始密碼③TAA、TAG、TGA終止密碼如：可溶性受體的表達(dá)，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，只有膜外區(qū)。,3.模板： 可選：DNA mRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNA DNA包括： 質(zhì)粒 噬菌體 染色體DNA 較小

23、 較大 ①目的gene是單拷貝 變性較易 變性較難 ②非常大，變性難 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染,4.dNTP：四種脫氧核苷酸，基本原料終濃度：50?M 注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長會失效,5.Mg2+ TaqDNA

24、聚合酶作用時(shí)需要Mg2+ 不同的酶需不同Mg2+ Taq：較少，Mg2+ 對反應(yīng)影響很大，0.5-1.5mM終濃度 pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍 外界影響： EDTA鰲合Mg2+ ∴選較低濃度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+ 結(jié)合， 降低Mg2+ 有效濃度。 ∴如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的 Mg2+濃度

25、,（1）變性溫度：94-95℃ Templete：GC比例高、長度很長，則變性T↑ （2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好取決于Tm值：Tm↑退火T↑； Tm↓退火T↓若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3）延伸：?500nt---1min ?500nt－－3min一般：40－60sec,6.溫度和時(shí)間：,（三）PCR技術(shù)的應(yīng)用,1. 基因檢測：2. 基因克隆化3. DNA突變

26、4. DNA序列分析,四、基因芯片,利用核酸雜交的原理，應(yīng)用于DNA、RNA的研究,操作流程,（1）探針的設(shè)計(jì)、合成與芯片的制作（商品化產(chǎn)品）；（2）靶基因樣品的制備； 靶基因的制備：RT-PCR （設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組） 標(biāo)記方法：分別進(jìn)行熒光素標(biāo)記如：Cy3和Cy5（3）生化雜交反應(yīng)；與常規(guī)的分子雜交過程基本相似 封閉 預(yù)雜交 雜交

27、洗脫（4）雜交信號的檢測與結(jié)果的分析 激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)收集熒光信號，計(jì)算機(jī)分析,,,,基因芯片的應(yīng)用,用于基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測、基因組分析和后基因組研究 舉例：美國斯坦福大學(xué)Davis等用PCR法從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA片段，制成芯片，然后與熱處理的T淋巴細(xì)胞和未處理的T細(xì)胞種提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈cDNA片段雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表

28、達(dá)的基因，其中11個(gè)是被熱誘導(dǎo)的，6個(gè)是被熱抑制的。經(jīng)序列分析證實(shí)，其中3個(gè)是未報(bào)導(dǎo)的新基因。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析技術(shù),講述內(nèi)容：一、Western Blot 二、ELISA三、免疫熒光技術(shù)四、免疫組織化學(xué)技術(shù) 五、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),一 Western Blot,1 原理：將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特

29、異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。,2 操作過程,SDS-PAGE電泳 轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉 一抗 洗滌 酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌 顯色或化學(xué)發(fā)光顯影,,,,,,

30、,,Hours 0 4 8 16,Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20?M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buf

31、fer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control,,0h 4h 8h 16h,Western Blot analysis of cytochrome C release.,Cytochrome c release from mitoch

32、ondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c sp

33、ecific antibody.,Cyto-C,X-Protein,3 注意的問題,（1） 蛋白質(zhì)電泳常用SDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。,聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套,（2）轉(zhuǎn)膜,戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫钄噢D(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致以

34、適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極排去濾紙、膠和膜間的氣泡。電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置,（3）封閉,用5％脫脂奶粉或3％BSA（含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）時(shí)間：室溫2h或4º

35、C過夜,（4）顯色或顯影,顯色辣根過氧化物酶：底物為DAB堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT化學(xué)發(fā)光顯影最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次 曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定,（5）膜的再利用,化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的

36、Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ） 用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用3－4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交,1 原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)

37、而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。,二、ELISA,ELISA 常用的酶和底物,辣根過氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色 ，檢測波長492nm TMB， 藍(lán)綠色，檢

38、測波長450nm 堿性磷酸酶，底物為PNPP（對－消基苯磷酸酯）, 黃色 檢測波長405nm ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間 包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml 封閉：37ºC 2h 或4ºC過夜（3％BSA） 樣本反應(yīng)時(shí)間：37ºC 45min-1h 酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間： 37ºC 45m

39、in-1h 顯色時(shí)間：15min(避光） 設(shè)對照 可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?2 類型,（1）間接法測抗體,間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗 體，檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。,方法： 抗原包被 封閉 待檢抗體 洗滌 酶標(biāo)

40、二抗 洗滌 顯色反應(yīng) 終止反應(yīng) ELISA Reader檢測 OD值,,,,,,,,,(2) 雙抗體夾心法測抗原,是檢測抗原最常用的方法。 只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 常用的組合：單克隆抗體＋多克隆抗體 單克隆抗體＋單克隆抗體 后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上

41、不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 用途：測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用 于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成 兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測。,,雙抗體夾心法測抗原的方法： 捕獲抗體包被 封閉（3％BSA） 待測抗原 洗滌（含0.1％Tween的PBS) 酶標(biāo)單抗或多抗 洗滌

42、顯色 檢測,,,,,,,,(3)競爭法測抗原,1）抗體固相測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。方法：抗體包被 封閉 同時(shí)加入待測抗原和酶標(biāo)抗原 洗滌 酶底物

43、 顯色 ELISA reader檢測,,,,,,,,2）抗原固相測抗原,其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。方法: a: 抗原包被96孔板； b:封閉; c: 待測抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間； d: 加入96孔板 e: 洗滌 f：加入酶標(biāo)二抗 g：洗滌

44、 h：顯色和檢測,,如臨床血清樣本的檢測以及細(xì)胞培養(yǎng)上清的檢測,（4）IgM抗體的檢測,1）間接法： 間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處

45、理，以除去IgG的干擾。,,方法,,a: 抗原包被96孔酶標(biāo)板； b:封閉; c: 待測血清與A蛋白反應(yīng)一定時(shí)間后離心 d: 吸取上清液加入96孔酶標(biāo)板 e: 洗滌 f：加入酶標(biāo)抗IgM的抗體 g：洗滌 h：顯色和檢測,2）捕獲包被法（夾心法）先用抗人IgM抗體包被ELISA板，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（包括針對抗原特異性的

46、IgM和非特異性的IgM)。然后加入相應(yīng)抗原，繼而加入針對抗原特異的酶標(biāo)抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標(biāo)本中的IgM含量成正相關(guān)。方法：,a: 抗人IgM抗體包被96孔酶標(biāo)板； b:封閉; c: 加入待測血清； d: 洗滌96孔酶標(biāo)板 e: 加入相應(yīng)抗原 f：加入抗原特異的酶標(biāo)抗體 g：洗滌 h：顯色和檢測,（5） ABS-ELISA

47、技術(shù) （Avidin Biotin system-ELISA,原理親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基有一個(gè)生物素分子結(jié)合點(diǎn)。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種材料所標(biāo)記，成為一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素化抗體可捕獲多個(gè)親和素，后者再與酶結(jié)合，加入底物后，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這一系統(tǒng)可以大大提高ELISA的靈敏度。,操作過程：抗原包被 封閉 待檢標(biāo)

48、本 生物素化抗體 洗滌 酶標(biāo)記親和素 洗滌 加底物顯色和檢測,,,,,,,,三 免疫熒光技術(shù),利用某些熒光素，如FITC、R-PE等通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測未知抗原或相應(yīng)配體。,（一）細(xì)胞膜蛋白分子的檢測,

49、原理：細(xì)胞膜表面的抗原或受體可特異地與相應(yīng)的抗體或配體結(jié)合，將針對細(xì)胞表面抗原的抗體或配體用不同的熒光素標(biāo)記，根據(jù)不同熒光物質(zhì)的最大激發(fā)和發(fā)射波長的不同，即可準(zhǔn)確定量每種熒光物質(zhì)的強(qiáng)度，從而推出相應(yīng)細(xì)胞表面抗原表達(dá)量,,1 直接法：細(xì)胞＋熒光素標(biāo)記的抗CD分子的抗體 4ºC反應(yīng)30-60min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析。2 間接法：細(xì)胞＋抗CD分子的抗體 4º

50、C 反應(yīng)30-60min 熒光素標(biāo)記的二抗 4ºC 反應(yīng)30-60min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析,,,,,,懸浮細(xì)胞：用PBS洗二次后再做染色貼壁細(xì)胞：先用胰酶消化成懸浮細(xì)胞再染色,1 細(xì)胞膜CD分子的檢測,2 Annexin V檢測技術(shù) (檢測細(xì)胞凋亡的一個(gè)常規(guī)指標(biāo)),磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS

51、可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。,原理,,樣本處理和染色方法,,1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5~1×106）用PBS

52、洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照?！　? 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮

53、細(xì)胞?！　? 爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。,,,（二）細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的檢測,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的檢測等。,操作過程：（1）直接法： 細(xì)胞 3％多聚甲醛固定和 滲透化 封閉 熒光素標(biāo)記的 抗體 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析 （2）間接法： 細(xì)胞 3％多聚甲醛

54、固定和滲透化 封閉 針對蛋白的特異 抗體 洗滌 熒光素標(biāo)記的二抗 洗滌 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析,,,,,,,,,,,,,凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析,TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識產(chǎn)權(quán)的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的T

55、FAR19單克隆抗體為探針，對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件

56、，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。,,1 懸浮細(xì)胞的染色：　?。?）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.5~1×106），PBS洗2次， 　?。?）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min?！　。?）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，　?。?）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min?！　。?）加入 FITC標(biāo)記的TFAR19單抗，4°C反應(yīng)30min

57、　?。?）熒光細(xì)胞洗液洗2次，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。　　2：貼壁細(xì)胞的原位染色　?。?） 貼壁生長的對數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到50%~80%滿時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。 　?。?） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。 　（3） 將染色的

58、爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ul）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。,,,原理：是指酶標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成色反應(yīng)，對相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位和定量測定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙的結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體

59、等），并可在原位顯示相應(yīng)的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物。,四免疫組織化學(xué)技術(shù),免疫組化染色技術(shù)的分類,免疫熒光法（Immunofluorescence technique）免疫酶法（Immunoperoxidase technique）免疫金銀法（（Immunogold technique）ABC法（ Avidin-Biotin Complex）,五 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),,1 GST融合蛋白進(jìn)行Pulldow實(shí)驗(yàn),（1）原理

60、 細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽s－轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在得到目標(biāo)蛋白的抗體前，或發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。 兩種應(yīng)用： 1）確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用

61、 2）證實(shí)探針蛋白與已知蛋白質(zhì)間可疑的相互作用,（2）方法：,1） GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a, 單一明確的重組蛋白；b，細(xì)胞裂解蛋白混合液；c, 體外翻譯cDNA表達(dá)得到的未知蛋白） 2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng) 4ºC 2h 3）離心棄上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，離心 5）取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳， 6）考

62、馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進(jìn)一步做質(zhì)譜分析確 定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做Western Blot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 該實(shí)驗(yàn)設(shè)立GST對照，反應(yīng)均在4ºC進(jìn)行,,GST-Pulldown Assay,2 免疫共沉淀,（1）原理當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

63、這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔缺點(diǎn)：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用,,免疫共沉淀檢測蛋白質(zhì)的原理和常見問題,（2）方法,1) 收獲培養(yǎng)的細(xì)胞（1×107－1×108）冷PBS洗滌2次2）細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min3) 12000rpm 離心 30min4）收集上清并加入適量抗體，4ºC搖動(dòng)1h5）加入Pro

64、teinG-Sepharose懸液， 4ºC搖動(dòng)1h6）細(xì)胞裂解液洗滌ProteinG-Sepharose混合液7）離心棄上清8）沉淀加2×蛋白Loading Buffer煮沸5－10min9）離心，上清液跑SDS-PAGE 膠10）考馬氏亮蘭染色、銀染 Western Blot 質(zhì)譜分析,（3）注意的問題,1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白

65、質(zhì) 相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。 不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用3）使用對照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔IgG,（1）原理：將編碼某一蛋白X的

66、DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。,3 酵母雙雜交系統(tǒng),雙雜交系統(tǒng)的原理

67、,,,,,,LacZ,Gal4激活域,Gal4結(jié)合域,,,,Gal4結(jié)合域,,LacZ,,,,,,,LacZ,Gal4激活域,,,,,,,,,LacZ,,Gal4激活域,Gal4結(jié)合域,X,Y,X,Y,1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒

68、，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。,用途,4 蛋白質(zhì)芯片,其制作原理類似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的樣品是提純的蛋白、多肽。其檢測的原理類似于抗原、抗體檢測的ELISA法。如采用雙抗夾心的形式，可通過機(jī)械點(diǎn)涂的方法，將多種不同的單克隆抗體點(diǎn)樣固定在固相介質(zhì)表面，如PVDF膜上，制備成抗體蛋白芯片，與制備的