豬圓環(huán)病毒Ⅱ型誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的信號途徑.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是一個小的共價閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒。該病毒是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemicsyndrome，PMWS)的主要病原，另外它與多種豬病密切相關(guān)，如繁殖障礙、肉芽腫性腸炎、豬皮炎腎病綜合征等，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究首先通過TMT標(biāo)記的定量磷酸化蛋白組技術(shù)，對PCV2作用豬肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary

2、 alveolarmacrophages，PAMs)6 h后的差異磷酸化蛋白進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了213個差異表達(dá)磷酸化蛋白;其中線粒體抗病毒信號(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)磷酸化蛋白顯著上調(diào)，提示PCV2引發(fā)先天免疫激活;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response gene88，MyD88），干擾素調(diào)節(jié)

3、因子(interferon regulatory factors，IRFs)，DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors，DAI)和視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白1（retinoic acid induced gene-1，RIG-1）在PCV2感染誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生中起著重要的作用;另外，研究表明RIG-1和DAI能夠影響PCV2的復(fù)制，這些研究為闡明PC

4、V2的免疫特性和感染機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.TMT定量分析PCV2感染仔豬肺泡巨噬細(xì)胞差異磷酸化蛋白的表達(dá)
　　豬巨噬細(xì)胞是PCV2在體內(nèi)的靶細(xì)胞之一。為了深入研究PCV2作用原代培養(yǎng)PAMs磷酸化位點(diǎn)的變化情況，運(yùn)用質(zhì)譜分析定量的等量異位標(biāo)簽技術(shù)(Tandem MassTag，TMT)，對PCV2作用PAMs6 h后的差異磷酸化蛋白進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了213個差異表達(dá)磷酸化蛋白，其中87個磷酸化蛋白顯

5、著上調(diào)（含102個磷酸化位點(diǎn)），126個磷酸化蛋白顯著下調(diào)（含178個磷酸化位點(diǎn)）。這些蛋白涉及生物結(jié)合、細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞黏附等。了解這些差異表達(dá)磷酸化蛋白，為進(jìn)一步研究PCV2的致病機(jī)理提供了線索。
　　2.NF-κB在PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌Ⅰ型干擾素信號途徑中的作用
　　核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)通過與干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferonregulatory fa

6、ctor3，IRF3)和干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulatory factor7，IRF7）相互協(xié)作參與Ⅰ型干擾素分泌，在機(jī)體先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。為了研究NF-κB在PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌Ⅰ型干擾素信號途徑中的作用，將無菌分離的PAMs，隨機(jī)分為四紐:對照組、PCV2組、NF-κB-抑制劑組（抑制劑組）和NF-κdB抑制劑-PCV2組（抑制劑-PCV2組）進(jìn)行體外培養(yǎng)。向接免疫熒光法(indirect

7、immunoinfluscent assay，IFA)定位檢測結(jié)果表明，PCV2可感染PAMs，并主要存在于細(xì)胞漿中;Western Blot方法檢測結(jié)果表明，較強(qiáng)的NF-κB抑制劑BAY11-7082抑制了抑制性κB(inhibitor ofNF-κB，IκB)的磷酸化，進(jìn)而抑制IκdBα降解和隨后的NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)。ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中α干擾素(interferonα，IFN-α)和β干擾素(interferonβ，IFN

8、-β)的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)PCV2能誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-α;而抑制NF-κB活化后，PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-α的作用并未下降，表明NF-κdB信號途徑可能不參與PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-Ⅰ的過程。
　　3.PCV2通過MyD88-IRFs信號途徑誘導(dǎo)PAMsⅠ型干擾素的表達(dá)
　　為了進(jìn)一步闡明PCV2引起PAMs分泌IFN-Ⅰ的信號途徑，采用siRNA方法將MyD88基因沉默，探討MyD88-IRFs信號途徑在

9、PCV2誘導(dǎo)PAMs分泌IFN-Ⅰ中的作用。結(jié)果表明，PCV2上調(diào)IFN-α基因轉(zhuǎn)錄與IKKα、IRF7和IRF3有極大的關(guān)系。干擾PAMs中MyD88基因后，減弱了PCV2對IKKα、IRF3、IRF7和IFN-α的轉(zhuǎn)錄上調(diào)作用。另外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IFN-α與IRF3，IRF7，MyD88之間呈顯著的正相關(guān)性，而IFN-β與IRF3、IRF7之間也呈顯著的正相關(guān)性。這些結(jié)果都表明PCV2可以通過MyD88-IRF(s)信號途徑影響Ⅰ

10、型干擾素的表達(dá)。
　　4.PCV2通過RIG-1和DAI影響PK15細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素作用的初步研究
　　RIG-1和DAI是Ⅰ型干擾素產(chǎn)生途徑的上游信號分子。為了研究RIG-1和DAI是否影響PCV2誘發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，針對豬RIG-1和DAI基因的保守區(qū)分別設(shè)計4對shRNA序列，同時設(shè)計1對陰性對照序列，構(gòu)建重組慢病毒。將獲得的濃縮重組慢病毒侵染PK15細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選，獲得具有抗性的陽性細(xì)胞，單克隆篩選后，

11、通過熒光定量PCR和Western Blotting的方法驗證干擾效率，成功獲得了細(xì)胞內(nèi)RIG-1和DAI基因和蛋白呈穩(wěn)定低水平表達(dá)的PK15-shRIG-1和PK15-shDAI細(xì)胞系。用PCV2感染PK15-shRIG-1和PK15-shDAI細(xì)胞系后Ⅰ型干擾素產(chǎn)生水平顯著下降;而且PK15-shRIG-1和PK15-shDAI細(xì)胞系中PCV2的復(fù)制能力顯著降低。表明RIG-1和DAI信號可能參與了PCV2誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生過程，